专利名称：茄子游离小孢子愈伤组织诱导及植株再生方法
技术领域：
本发明涉及一种植物培育方法，特别是涉及一种茄子的单倍体育种方法。
背景技术：
目前，在茄子育种工作中，自交系的选育是非常重要的工作，但往往存在再生周期长 等问题。单倍体育种是解决这一问题的重要的育种方法之一，可以大大提高育种选择的效 率，縮小育种群体的规模，并縮短育种年限。单倍体在遗传与育种的应用和意义 一加速 遗传性纯化、縮短育种年限；二可以从配子水平鉴别遗传分离类型，提高选择效率；三可 以有效地利用微生物遗传技术于高等植物；四利用花粉愈伤组织或植物组织的倍数性化， 诱导产生倍数性植物；五提高远缘杂交在育种上的利用，克服远缘杂交的不亲和性，克服 远缘杂交种的不孕性；六是遗传研究的良好实验材料；七突变体的筛选；八遗传转化的受 体材料等。
从分子生物学角度看，获得单倍体的重要意义还在于通过利用花药(粉)培养诱导的 单倍体经染色体加倍后得到高纯度的纯合双单倍体，由其所建立起来双单倍体群体(DH), 在遗传上是纯合的基因组，DH群体是比较理想的分子标记作图群体之一，是RFLP、 AFLP、 RAPD、 SSR等分子标记和基因图谱的理想材料，可避免二倍体来自双亲的两条染色体在DNA
碱基序列的细微差别，从而大大提高基因定位标图的准确性。
花药培养与小孢子培养是获得单倍体的有效的方法。但目前在花药培养中仍存在着很
多问题需要解决，由于花药各部分组织的干扰，培育产物可能不是由花粉而来的，致使产 生不同倍性的体细胞混杂体。
发明内容
本发明所解决的技术问题是提供一种茄子游离小孢子愈伤组织诱导及植株再生方法， 本方法得到单倍体的机率高、小孢子愈伤组织发生频率高，不仅是茄子单倍体育种技术上 的突破，而且该游离小孢子培养胚状体诱导体系还可能成为进行植物细胞分化、发育研究， 分子标记和基因图谱的良好实验体系。
一种茄子游离小孢子愈伤组织诱导及植株再生方法，主要步骤是选取合适的花药进行 预培养，然后进行小孢子的游离和收集，然后在液体培养基中进行静止浅层暗培养，20 30d后陆续出现愈伤组织，愈伤组织出现后于光照下培养，当愈伤组织块径长到2 6咖时，
将愈伤组织转到固体再生培养基上继续培养，30 45d愈伤组织上开始分化出芽点，当芽点 长到1 3 cm时转到生根培养基，10 15d后长出健壮的根。
本发明茄子游离小孢子愈伤组织诱导及植株再生方法，其中所述选取花药步骤选取在 自然条件下生长健壮植株上的盛花期即对茄、四门斗时期的花蕾。
本发明茄子游离小孢子愈伤组织诱导及植株再生方法，其中所述花药的预培养包括如 下步骤
d) 消毒花蕾；
e) 接种在超净工作台上，从灭好菌的花蕾中轻轻剥取花药接种于装有预培养基i的 培养皿中，每培养皿接2 3个花蕾的花药，每培养皿装有8 10mL培养基；
f) 热激处理将接种好的花药放到暗培养箱内进行热激处理，热激温度为30 36'C， 处理时间为4 8d;
其中所述的预培养基i如下MS培养基、和0. 05 0. 5mg 'L—12, 4-D、和0. 5 2mg *L—'KT、 和6 10mg'L—'Vc、和2 4%蔗糖、和5 10g L—'琼脂，培养基pH值为5. 5~7，采用高压 灭菌121。C下灭菌15 20min。
本发明茄子游离小孢子愈伤组织诱导及植株再生方法，其中所述小孢子的游离和收集 包括如下步骤-
d) 用无菌的镊子从预培养过的花药中选取无污染、无褐化且膨大的花药放到一无菌的 培养皿中；
e) 将洗涤培养基ii加入上面的培养皿中，用无菌的手术刀切开花药并挤压，以使小孢 子从花药中游离到洗涤培养基ii中；
f) 将上述含有小孢子的洗涤培养基ii经200目尼龙筛网过滤，收集滤液于500rpm离心 1 10min，去掉上清，沉淀再离心，重复3次；
其中所述的洗涤培养基ii如下MS培养基和2 3%蔗糖，pH值为5.5 7，采用高 压灭菌115 121。C下灭菌15 20min。 本发明茄子游离小孢子愈伤组织诱导及植株再生方法，其中所述游离小孢子的培养包 括如下步骤
c) 离心后的小孢子用液体培养基iii稀释至小孢子密度2 4X105个 mL—1 ，分装到无菌 培养皿中，每皿3 5mL，用Parafilm封口；
d) 将培养皿放进培养盒内，在25 28'C下，进行静止浅层暗培养至愈伤组织出现，15 20d后换一次新鲜的液体培养基iii， 20 30d后陆续出现愈伤组织，愈伤组织出现后
拿到光照强度1500 2000Lx、光照12 16h d—'下培养； 其中所述的液体培养基iii可以是如下的培养基中的任一种
a. KM培养基、和0. 05 0. 5mg I/1 2， 4 D、和0. 1 0. 5mg L-1KT、和0. 5 2mg L,AA、 和100 300mg L，EG、和5 7%葡萄糖；
b. KM培养基、和0. 5 2mg L—'歸、和l 3mg L_1KT、和150 300mg L-1PEG、和5 10% 葡萄糖；
液体培养基iii用0. 22Pm —次性滤器过滤灭菌。
本发明茄子游离小孢子愈伤组织诱导及植株再生方法，其中所述愈伤组织的再生包括 如下步骤当愈伤组织块径长到2 6mm时，将愈伤组织转到固体再生培养基iv中，15 20d 继代一次，30 45d愈伤组织上开始分化出芽点；
其中所述的再生培养基iv如下MS培养基、和0 0. 2mg 'L—'NAA、和0. 5 5mg *L—'6-BA 、 和1 5%蔗糖、和5 10g L-'琼脂。
本发明茄子游离小孢子愈伤组织诱导及植株再生方法，其中所述再生植株的生根包括 如下步骤当芽点长到1 3cm时转到生根培养基v, 10 15d后长出健壮的根；其中所述 的生根培养基v如下1/2 MS培养基、和0. 05 0. 5mg 'L—'IBA、和1 5%蔗糖、和5 10g '1/1 琼脂。
本发明茄子游离小孢子愈伤组织诱导及植株再生方法，其中所述花药的选取最好是通 过镜检观察小孢子的发育时期，选取单核中期和靠边期的小孢子，对应的花蕾外部特征为 花冠低于花萼l 2mm至花冠高于花萼l 2mm,萼片即将开裂前后，花药为黄绿色。
本发明茄子游离小孢子愈伤组织诱导及植株再生方法，其中所述花蕾消毒步骤采用 70 75%的酒精进行花蕾表面消毒，消毒时间l 3min，然后用5. 0 8. 0%的次氯酸钠浸泡 5 40min，最后用无菌水洗涤3次，每次1 10min，用无菌纸吸干备用。
本发明茄子游离小孢子愈伤组织诱导及植株再生方法中的小孢子培养可以克服花药培 养的缺陷，小孢子培养与花药培养相比有如下几点优点 一、可以排除花药壁、花药隔等 体细胞组织的影响，消除了药壁和其他相关组织不能控制的影响，并且能够较好地调节支 配雄核发育的各种因素；二、培养中不存在花粉竞争问题，可以提高得到单倍体的机率； 三、小孢子培养能在更大的基因型范围内以更高频率诱导小孢子愈伤组织发生；四可以观 察到单个细胞开始雄核发育的全过程；五由于小孢子能均匀地接触化学的和物理的诱变因 素，因此小孢子也是研究吸收、转化和诱变的理想材料；总之，在单倍体诱导和遗传育种 研究效率上，显示出比花药培养高得多的潜力。
随着科学技术的发展，小孢子培养应用范围日趋广泛(1)在基础科学中通过对小孢 子在培养过程中脱分化，再分化及细胞内的相应生理生化变化的研究，对实验胚胎学、生 理学和分子生物学中基因表达和调控机理的研究都有很大帮助。(2)由于小孢子数量大，
单个状态体积小且形态均一，因而便于在人工控制条件下研究其生长、分化和遗传转化过 程，例如人工诱变花粉、染色体功能鉴定等。(3)小孢子植株隐性性状容易表现，因而植 株类型多样，同时可以得到纯合的单倍体、双单倍体以及异源附加系和代换系，提供了多 种遗传分析材料，加速了育种进程。(4)小孢子为单细胞，具有天然的分散性，数量巨大，
易于获得，所以小孢子培养具有与单细胞微生物系统相似的所有优势，加上小孢子胚胎发
生和植株再生能力强，因而能用于胚胎的克隆和新基因型或突变体的大量快速繁殖。(5) 从分子生物学角度看，单倍体的重要意义还在于通过此法所建立起来的双单倍体群体
(doubled haploid progenies),因为DH群体在遗传上是纯合的基因组，所以是AFLP、 RAPD、 SSR等分子标记和基因图谱的理想材料，可避免二倍体由于来自双亲的两条染色体在 DNA碱基分子碱基序列的细微差异，从而大大提高基因定位标图的准确性。
具体实施例方式
实施例1:
一种茄子游离小孢子愈伤组织诱导及植株再生方法，包括如下步骤
(1) 选取花药选取在自然条件下生长健壮植株上的盛花期即对茄、四门斗的花蕾，通过 镜检观察小孢子的发育时期，选取单核中期和靠边期的小孢子，对应的花蕾外部特征为花
冠低于花萼l 2iM至花冠高于花萼l 2mm,萼片即将开裂前后，花药为黄绿色。
(2) 花药的预培养包括如下步骤
a) 消毒花蕾采用70 75%的酒精进行花蕾表面消毒，消毒时间2min，然后用6. 5% 的次氯酸钠浸泡10 15min，最后用无菌水洗涤3次，每次5min，用无菌纸吸干备 用；
b) 接种在超净工作台上，从消好菌的花蕾中轻轻剥取花药接种于装有预培养基i的 培养皿(O60mm)中，每培养皿接2个花蕾的花药，每培养皿装有8 10mL培养基；
c) 热激处理将接种好的花药放到暗培养箱内进行热激处理，热激温度为32'C，处理 时间为8d (天)；
(3) 小孢子的游离和收集包括如下步骤
a)用无菌的镊子从预培养过的花药中选取无污染、无褐化且膨大的花药放到一无菌的 培养皿中；
b) 将洗涤培养基ii加入上面的培养皿中，用无菌的手术刀切开花药并挤压，以使小孢 子从花药中游离到洗涤培养基ii中；
c) 将上述含有小孢子的洗涤培养基ii经200目尼龙筛网过滤，收集滤液于500rpm离心 5min，去掉上清，沉淀再离心，重复3次；
(4) 游离小孢子的培养包括如下步骤
a) 离心后的小孢子用液体培养基iii稀释至所需浓度(用血球计数板计数)，小孢子密度 3X1()5个 ml/1,分装到无菌培养皿(060咖)中，每皿5mL，用Parafilm封口；
b) 将培养皿放进培养盒内，在25 28'C下，进行静止浅层暗培养至愈伤组织出现，每 15d左右换一次新鲜的液体培养基iii， 30d后陆续出现愈伤组织，愈伤组织出现后拿 到光照强度2000Lx、光照16h cT下培养；
(5) 愈伤组织的再生当愈伤组织块径长到3 5 mm时，将愈伤组织转到固体再生培养基 iv中，20d继代一次，45d愈伤组织上开始分化出芽点；
(6) 再生植株的生根当芽点长到2 3cm时转到生根培养基v， 10d后长出健壮的根； 其中所述的培养基如下
预培养基i : MS+0. 5mg L-12, 4-D+2mg 匚'KT+10mg L—'Vc+4M蔗糖+10g L 1琼脂，培养基 pH值为6.4，采用高压灭菌12rC下灭菌15 20min;
洗涤培养基ii: MS+2呢蔗糖，pH值为6.4，采用高压灭菌115 121'C下灭菌15 20min; 液体培养基iii:
a. KM+0. 5mg L-12, 4-D+0. 5mg , !/'KT+2rag L,AA+300mg L—'PEG +7%葡萄糖；
b. KM+2mg L_1NAA+3mg L-1KT +300mg L—'PEG +10%葡萄糖; 液体培养基iii用0. 22Mm —次性滤器过滤灭菌；
再生培养基iv: MS+O. 2mg L—'NAA+5mg l/'6-BA+5M蔗糖+10g IZ'琼脂； 生根培养基v : 1/2MS+0. 5mg 1/'IBA+5y。蔗糖+10g 1/'琼脂。 实施例2:
一种茄子游离小孢子愈伤组织诱导及植株再生方法，包括如下步骤
(1) 选取花药选取在自然条件下生长健壮植株上的盛花期即对茄、四门斗的花蕾，通过
镜检观察小孢子的发育时期，选取单核中期和靠边期的小孢子，对应的花蕾外部特征为花 冠低于花萼l 2咖至花冠高于花萼l 2mm，萼片即将开裂前后，花药为黄绿色。
(2) 花药的预培养包括如下步骤
d) 消毒花蕾采用70 75%的酒精进行花蕾表面消毒，消毒时间2min，然后用6. 5% 的次氯酸钠浸泡10 15min，最后用无菌水洗涤3次，每次5min，用无菌纸吸干备 用；
e) 接种在超净工作台上，从消好菌的花蕾中轻轻剥取花药接种于装有预培养基i的 培养皿(C>60ram)中，每培养皿接3个花蕾的花药，每培养皿装有8 10mL培养基；
f) 热激处理将接种好的花药放到暗培养箱内进行热激处理，热激温度为35'C，处理 时间为8d (天)左右；
(3) 小孢子的游离和收集包括如下步骤
d) 用无菌的镊子从预培养过的花药中选取无污染、无褐化且膨大的花药放到一无菌的 培养皿中；
e) 将洗涤培养基ii加入上面的培养皿中，用无菌的手术刀切开花药并挤压，以使小孢 子从花药中游离到洗涤培养基ii中；
f) 将上述含有小孢子的洗涤培养基ii经200目尼龙筛网过滤，收集滤液于500rpm离心 5min，去掉上清，沉淀再离心，重复3次；
(4) 游离小孢子的培养包括如下步骤
c) 离心后的小孢子用液体培养基iii稀释至所需浓度(用血球计数板计数)，小孢子密度 2X1()5个 mL—'，分装到无菌培养皿(0>60,)中，每皿5mL，用Parafilm封口；
d) 将培养皿放进培养盒内，在25 28'C下，进行静止浅层暗培养至愈伤组织出现，每 15d左右换一次新鲜的液体培养基iii, 30d左右陆续出现愈伤组织，愈伤组织出现后 拿到光照强度1500Lx、光照12h.cT下培养；
(5) 愈伤组织的再生当愈伤组织块径长到3 5 mm时，将愈伤组织转到固体再生培养基 iv中，20d左右继代一次，45d左右愈伤组织上开始分化出芽点；
(6) 再生植株的生根当芽点长到2 3cm时转到生根培养基v， 10d左右长出健壮的根； 其中所述的培养基如下-
预培养基i : MS+0. 05mg L_12， 4-D+0. 5mg L—KT+6mg L—Vc+2y。蔗糖+5g L '琼脂，培养基 pH值为5.5，采用高压灭菌12rC下灭菌15 20min;
洗涤培养基ii: MS+2M蔗糖，pH值为5.5，采用高压灭菌115 121。C下灭菌15 20min; 液体培养基iii:
a. KM+0. 05mg L-12, 4-D+0. lmg L—'KT+O. 5mg L"磁+100mg L'PEG +5%葡萄糖;
b. KM+0. 5mg L墨'隐+lmg L—'KT +150mg L—屮EG +5%葡萄糖; 液体培养基iii用0. 22m —次性滤器过滤灭菌；
再生培养基iv: MS+0. 5mg U16-BA+W蔗糖+5g L—'琼脂； 生根培养基v : 1/2MS+0. 05mg L—'IBA+l呢蔗糖+5g L—'琼脂。 实施例3:
一种茄子游离小孢子愈伤组织诱导及植株再生方法，包括如下步骤
(1) 选取花药选取在自然条件下生长健壮植株上的盛花期即对茄、四门斗的花蕾，通过
镜检观察小孢子的发育时期，选取单核中期和靠边期的小孢子，对应的花蕾外部特征为花
冠低于花萼l 2mm至花冠高于花萼l 2皿，萼片即将开裂前后，花药为黄绿色。
(2) 花药的预培养包括如下步骤
g) 消毒花蕾采用70 75%的酒精进行花蕾表面消毒，消毒时间2min，然后用6. 5% 的次氯酸钠浸泡10 15min，最后用无菌水洗涤3次，每次5min，用无菌纸吸干备
用；
h) 接种在超净工作台上，从消好菌的花蕾中轻轻剥取花药接种于装有预培养基i的 培养皿(O60M1)中，每培养皿接2个花蕾的花药，每培养皿装有8 10mL培养基；
i) 热激处理将接种好的花药放到暗培养箱内进行热激处理，热激温度为36'C，处理
时间为6d (天)；
(3) 小孢子的游离和收集包括如下步骤
g) 用无菌的镊子从预培养过的花药中选取无污染、无褐化且膨大的花药放到一无菌的 培养皿中；
h) 将洗涤培养基ii加入上面的培养皿中，用无菌的手术刀切开花药并挤压，以使小孢
子从花药中游离到洗涤培养基ii中；
i) 将上述含有小孢子的洗涤培养基ii经200目尼龙筛网过滤，收集滤液于500rpm离心 5min,去掉上清，沉淀再离心，重复3次；
(4) 游离小孢子的培养包括如下步骤
e) 离心后的小孢子用液体培养基iii稀释至所需浓度(用血球计数板计数)，小孢子密度 4X1()5个 mL、分装到无菌培养皿(060顺)中，每皿5mL，用Parafilm封口；
f) 将培养皿放进培养盒内，在25 28'C下，进行静止浅层暗培养至愈伤组织出现，每 20d左右换一次新鲜的液体培养基iii, 30d后陆续出现愈伤组织，愈伤组织出现后拿 到光照强度2000Lx、光照16h'cT下培养；
(5) 愈伤组织的再生当愈伤组织块径长到3 5 rran时，将愈伤组织转到固体再生培养基 iv中，20d左右继代一次，45d左右愈伤组织上开始分化出芽点；
(6)再生植株的生根当芽点长到2 3cm时转到生根培养基v， 10d后长出健壮的根；
其中所述的培养基如下
预培养基i : MS+0. 2mg L-'2, 4-D+lmg L 'KT+8mg L—'Vc+3免蔗糖+7g L '琼脂，培养基pH 值为5.8，采用高压灭菌121'C下灭菌15 20min;
洗涤培养基ii: MS+3M蔗糖，pH值为5.8，采用高压灭菌115 121。C下灭菌15 20min; 液体培养基iii:
a. KM+0. 2mg L—12， 4-D+0. 5mg L—'KT+lmg L—'NAA+250mg L—'PEG +6. 5%葡萄糖；
b. KM+lmg L-1NAA+2mg l/'KT +250mg L—'PEG +6. 5%葡萄糖； 液体培养基iii用0. 22Mm —次性滤器过滤灭菌；
再生培养基iv: MS+O. Olmg L—'NAA+2mg L—16-BA+2")4蔗糖+7g L—'琼脂； 生根培养基v : 1/2 MS+O. 2mg LlBA+2M蔗糖+7g L^琼脂。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的构思和 范围进行限定，在不脱离本发明涉及方案前提下，本领域技术人员对本发明的技术方案作 出的各种显而易见的变型和改进，均应落入本发明的保护范围，本发明请求保护的技术内 容，已经全部记载在权利要求书中。
权利要求
1.一种茄子游离小孢子愈伤组织诱导及植株再生方法，其特征在于选取合适的花药进行预培养，然后进行小孢子的游离和收集，然后在液体培养基中进行静止浅层暗培养，20～30d后陆续出现愈伤组织，愈伤组织出现后于光照下培养，当愈伤组织块径长到2～6mm时，将愈伤组织转到固体再生培养基上继续培养，30～45d愈伤组织上开始分化出芽点，当芽点长到1～3cm时转到生根培养基，10～15d后长出健壮的根。
2. 根据权利要求1所述的茄子游离小孢子愈伤组织诱导及植株再生方法，其特征在于所 述选取花药步骤选取在自然条件下生长健壮植株上的盛花期即对茄、四门斗时期的花蕾。
3. 根据权利要求2所述的茄子游离小孢子愈伤组织诱导及植株再生方法，其特征在于所 述花药的预培养包括如下步骤-a) 消毒花蕾；b) 接种在超净工作台上，从灭好菌的花蕾中轻轻剥取花药接种于装有预培养基i的培养皿中，每培养皿接2 3个花蕾的花药，每培养皿装有8 10mL培养基；c) 热激处理将接种好的花药放到暗培养箱内进行热激处理，热激温度为30 36'C， 处理时间为4 8d;其中所述的预培养基i如下MS培养基、和0. 05~0. 5mg *L—'2, 4-D、和0. 5 2mg *L—'KT、 和6 10mg L/'Vc、和2 4%蔗糖、和5 10g L—'琼脂，培养基pH值为5. 5 7,采用高压 灭菌121。C下灭菌15 20min。
4. 根据权利要求3所述的茄子游离小孢子愈伤组织诱导及植株再生方法，其特征在于所 述小孢子的游离和收集包括如下步骤a) 用无菌的镊子从预培养过的花药中选取无污染、无褐化且膨大的花药放到一无菌的 培养皿中；b) 将洗漆培养基ii加入上面的培养皿中，用无菌的手术刀切开花药并挤压，以使小孢 子从花药中游离到洗涤培养基ii中；c) 将上述含有小孢子的洗涤培养基ii经200目尼龙筛网过滤，收集滤液于500rpm离心 1 10min，去掉上清，沉淀再离心，重复3次；其中所述的洗涤培养基ii如下MS培养基和2 3%蔗糖，pH值为5.5 7，采用高 压灭菌115 121。C下灭菌15 20min。
5. 根据权利要求4所述的茄子游离小孢子愈伤组织诱导及植株再生方法，其特征在于所述游离小孢子的培养包括如下步骤a) 离心后的小孢子用液体培养基iii稀释至小孢子密度2 4X105个 mL—1,分装到无菌 培养皿中，每皿3 5mL,用Parafilm封口；b) 将培养皿放进培养盒内，在25 28'C下，进行静止浅层暗培养至愈伤组织出现，每 15 20d换一次新鲜的液体培养基iii， 20 30d后陆续出现愈伤组织，愈伤组织出现 后拿到光照强度1500 2000Lx、光照12 16h cf'下培养；其中所述的液体培养基iii为如下培养基中的任一种a. KM培养基、和0. 05 0. 5mg L-1 2, 4 D、和0. 1 0. 5mg L-1KT、和0. 5 2mg L—'NAA、 和100 300mg L—'PEG、和5 7%葡萄糖；b. KM培养基、和0. 5 2mg L—'NAA、和1 3mg L—LKT、和150 300rag L—'PEG、和5 10% 葡萄糖；液体培养基iii用0. 22陶 一次性滤器过滤灭菌。
6. 根据权利要求5所述的茄子游离小孢子愈伤组织诱导及植株再生方法，其特征在于所 述愈伤组织的再生包括如下步骤当愈伤组织块径长到2 6mm时，将愈伤组织转到固体再 生培养基iv中，15 20d继代一次，30 45d愈伤组织上开始分化出芽点；其中所述的再生培养基iv如下MS培养基、和0 0. 2mg叱—'NAA、和0. 5 5mg *L—'6-BA 、 和1 5%蔗糖、和5 10g L—'琼脂。
7. 根据权利要求6所述的茄子游离小孢子愈伤组织诱导及植株再生方法，其特征在于所 述再生植株的生根包括如下步骤当芽点长到1 3cm时转到生根培养基v, 10 15d后长 出健壮的根；其中所述的生根培养基v如下1/2MS培养基、和0. 05 0. 5mg L—'IBA、和 1 5%蔗糖、和5 10g L—'琼脂。
8. 根据权利要求2所述的茄子游离小孢子愈伤组织诱导及植株再生方法，其特征在于所述花药的选取通过镜检观察小孢子的发育时期，选取单核中期和靠边期的小孢子，对应的 花蕾外部特征为花冠低于花萼1 2 mm至花冠高于花萼1 2 mm，萼片即将开裂前后，花药为黄绿色。
9. 根据权利要求3所述的茄子游离小孢子愈伤组织诱导及植株再生方法，其特征在于所 述花蕾消毒步骤采用70 75%的酒精进行花蕾表面消毒，消毒时间l 3min，然后用5. 0 8.0%的次氯酸钠浸泡5 40min，最后用无菌水洗涤3次，每次1 10min，用无菌纸吸干备用o
全文摘要
一种茄子游离小孢子愈伤组织诱导及植株再生方法，主要步骤是选取合适的花药进行预培养，然后进行小孢子的游离和收集，然后在液体培养基中进行静止浅层暗培养，20～30d后陆续出现愈伤组织，愈伤组织出现后拿到光照下培养，当愈伤组织块径长到2～6mm时，将愈伤组织转到固体再生培养基上继续培养，30～45d愈伤组织上开始分化出芽点，当芽点长到1～3cm时转到生根培养基，10～15d后长出健壮的根；本方法得到单倍体的机率高、小孢子愈伤组织发生频率高，不仅是茄子单倍体育种技术上的突破，而且该游离小孢子培养胚状体诱导体系还可能成为进行植物细胞分化、发育研究，分子标记和基因图谱的良好实验体系。
文档编号C12N5/04GK101371650SQ20071012074
公开日2009年2月25日 申请日期2007年8月24日 优先权日2007年8月24日
发明者刘富中, 孙振英, 燕 宋, 涵 徐, 适 范, 勇 连, 陈钰辉, 欣 马 申请人:中国农业科学院蔬菜花卉研究所