防止表没食子儿茶素和没食子酸被转化的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种防止表没食子儿茶素和没食子酸被 转化的方法。
【背景技术】
[0002] 茶饮料作为一种全球流行的植物饮料，其在抗癌和心血管等疾病的保健功效已 经得到公认。儿茶素是茶鲜叶中最主要的多酚类功能性物质，其含量占鲜叶干重的12~ 24%，多酚总量的70~80%。茶叶中的儿茶素主要由儿茶素（C)，没食子儿茶素（GC)，表儿 茶素（EC)，表没食子儿茶素（EGC)，表儿茶素没食子酸酯（ECG)和表没食子儿茶素没食子酸 酯（EGCG)组成。其中又以表没食子儿茶素没食子酸脂（EGCG)含量最高，占儿茶素总量的 50~60%。近年来大量研宄证实，茶多酚具有消除自由基、抗氧化等生物活性，在抑菌、抗 病毒、抑制肿瘤、防治心血管疾病等方面具有良好功效。
[0003] 事实上，喝茶后，茶多酚在消化道上段不能被分解利用，同时也很少被吸收。绝大 多数茶多酚（超过90%)进入到结肠，被结肠微生物所分解后再被结肠吸收，然后进入系统 循环起作用，一部分则被排出体外。因此，如何提高茶多酚的生物可利用度近年来已成为业 界关注的热点。2011年，J.A.Macedoetal利用Paecilomycesvariotii单宁酶生物转化 绿茶、巴拉圭茶提取物以及绿原酸和EGCG标品。研宄发现，采用丹宁酶转化茶多酚和EGCG 后其抗氧化活性和抗癌活性均有明显的增强。这就说明茶多酚通过生物转化可以显著提高 其生物利用度和生物活性。茶多酚体外转化是将在结肠中微生物的消化分解转移到体外进 行，相当于延长的动物消化道，可大大提高茶多酚的生物可利用度。
[0004] 茶多酚体外转化可选择酶转化的方式，而降解茶多酚的水解酶通常由霉菌产生。 四川大学直接利用其实验室筛选得到的黑曲霉降解茶多酚中儿茶素聚合体为儿茶素单 体。当蔗糖的添加量为30g/L，茶多酚浓度为8g/L，发酵60h，儿茶素产率达到最大值，为 26. 69 % ;随着茶多酚浓度继续升高，儿茶素产率呈下降趋势。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺点与不足，提供一种防止表没食子儿 茶素和没食子酸被转化的方法。
[0006] 本发明的目的通过下述技术方案实现：一种防止表没食子儿茶素和没食子酸被转 化的方法，采用黑曲霉（Aspergillusniger)RAF106菌株进行全细胞生物转化，全细胞生物 转化的营养液中加入质量份数2~10份糖用以阻止表没食子儿茶素和没食子酸被进一步 转化。
[0007] 所述的黑曲霉（Aspergillusniger)RAF106菌株，保藏日期为2014年8月27日， 保藏编号为CGMCC NO. 9608,保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC);保藏单位地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号（100101)。
[0008] 所述的黑曲霉（Aspergillusniger)RAF106菌株具有以下生物学特性：菌落表面 平坦，边缘整齐，培养基背面呈乳白色，中间稍有乳黄色，基内菌丝发达。在25°C的察氏平板 培养基上培养8d，RAF106菌落直径为51. 0±1. 53mm，边缘有少量白色绒毛状气生菌丝，菌 落表面呈灰褐色，表面有小滴状黑色渗透液（见图2)。菌落形态不规则，表面褶皱状，培养 基背面呈黑褐色。
[0009] 黑曲霉RAF106菌株rDNA-ITS全长碱基序列如SEQIDNO:1所示。
[0010] 所述的黑曲霉（Aspergillusniger)RAF106菌株应用种子培养基进行种子培养， 获得黑曲霉RAF106菌株的种子分生孢子；
[0011] 所述的种子培养基的配方为：马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH 自然，121°C灭菌20min。黑曲霉RAF106菌株的种子培养基也可使用市售的马铃薯蔗糖琼脂 (PDA)培养基。
[0012] 所述的种子培养的条件为：前子瓶静置培养，培养温度28~35°C，培养时间3~ 5d〇
[0013] 在所述的种子培养过程中，黑曲霉RAF106菌株的种子菌接种量为每毫升全细胞 生物转化的营养液接种1〇 2~10 8个黑曲霉RAF106菌株分生孢子。
[0014] 所述的黑曲霉RAF106菌株的种子分生孢子的获取方法为：采用无菌生理盐水冲 洗长满黑色黑曲霉分生孢子的茄子瓶，并以接种环轻轻刮取种子培养基表面，得到黑曲霉 分生孢子悬浮液。
[0015] 所述的全细胞生物转化为液态转化。
[0016] 所述的全细胞生物转化的营养液的配方为：茶多酚或EGCG 1~20份，磷酸氢二钾 0. 03~0. 8份，磷酸二氢钾0. 1~3份，硫酸锰0. 03~0. 7份，氯化钠0. 3~2份，硫酸镁 0. 01~0. 3份，酵母或麦芽提取物0. 02~2份，糖2~10份；121°C灭菌30min ;所述的份 数为质量份数。
[0017] 所述的糖优选为葡萄糖、蔗糖、淀粉、环化糊精、乳糖、甘露糖、麦芽糖、木糖、核 糖、阿拉伯糖、半乳糖、果糖、海藻糖、纤维二糖、土豆汁、豆芽汁和麦麸中的一种或者至少两 种混合物。
[0018] 所述的全细胞生物转化的条件为：温度25~42°C，摇床转速160~220r/min，时 间20~60h。
[0019] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0020] (1)本发明所筛选到的黑曲霉菌株，对茶多酚具有很高的耐受性，生物转化效率极 高，但在生物转化过程中，其代谢产物表没食子儿茶素和没食子酸会被进一步分解，本发明 的优势在于可以防止这两种物质被进一步分解，能对茶多酚降解所得的儿茶素单体没食子 酸（GA)、表没食子儿茶素（EGC)、表儿茶素（EC)具有一定的保护作用，即酯型儿茶素被黑曲 霉完全生物转化为非酯型儿茶素之后直至较长一段时间内，这些表没食子儿茶素和没食子 酸的浓度不降低。采用加糖保护的方法发酵转化茶多酚，其优势在于黑曲霉全细胞生物转 化工艺简单、快速，在实现茶多酚高效转化的同时，大大提高儿茶素的得率。
[0021] (2)茶多酚生物转化的同时，通过添加糖等成分，防止非酯型儿茶素和没食子酸被 进一步转化，大大提高表没食子儿茶素和没食子酸的得率。本发明采用黑曲霉全细胞一步 生物转化EGCG，简便高效，成本大大降低；茶多酚转化彻底，EGCG可100%得到转化。儿茶 素单体在EGCG转化结束较长时间内未被进一步分解，提高转化产物得率。
【附图说明】
[0022] 图1是实施例中黑曲霉产生酯酶对儿茶素进行生物转化的示意图；
[0023] 图2是实施例中黑曲霉RAF106菌株菌落的形态图，其中：A为PDA平板中黑曲霉 RAF106菌株菌落的形态图，B为察氏平板中黑曲霉RAF106菌株菌落的形态图；
[0024] 图3是实施例中经黑曲霉RAF106菌株生物转化茶多酚28h时的HPLC图谱，其中 A图为未加糖转化的茶多酚的HPLC图谱，B图为加糖、经黑曲霉RAF106菌株生物转化茶多 酚28h时HPLC图谱；
[0025] 图4是实施例中经黑曲霉RAF106菌株生物转化茶多酚112h时的HPLC图谱，其中 A图为未加糖转化的茶多酚的HPLC图谱，B图为加糖、经黑曲霉RAF106菌株生物转化茶多 酚112h时HPLC图谱；
[0026] 图5是实施例中经黑曲霉RAF106菌株生物转化EGCG 28h时的HPLC图谱，其中A 图为未加糖转化的EGCG的HPLC图谱，B图为加糖、经黑曲霉RAF106菌株生物转化EGCG28h 时HPLC图谱；
[0027] 图6是实施例中经黑曲霉RAF106菌株生物转化EGCG 90h时的HPLC图谱，其中A 图为未加糖转化的EGCG的HPLC图谱，B图为加糖、经黑曲霉RAF106菌株生物转化EGCG 90h 时HPLC图谱；
[0028] 图7是实施例中不同的糖对RAF106产单宁酶的影响结果；
[0029] 图8是实施例中加糖的转化混合液和未加糖的转化混合液中的EGCG分解结果。
【具体实施方式】
[0030] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。
[0031] 实施例1
[0032] 黑曲霉（Aspergillusniger)RAF106菌株，保藏日期为2014年8月27日，保藏编号 为CGMCC NO. 9608,保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC); 保藏单位地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号（100101)。
[0033] 黑曲霉RAF106菌株的种子培养基的配方为：马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂20g，蒸 馏水1000mL，pH自然，121°C灭菌15min。也可使用市售的马铃薯蔗糖琼脂（PDA)培养基。
[0034] 黑曲霉RAF106菌株的种子培养条件为：前子瓶静置培养，培养温度28°C，培养时 间4d。
[0035] 黑曲霉RAF106菌株的种子分生孢子的获取方法为：采用无菌生理盐水冲洗长满 黑色黑曲霉分生孢子的茄子瓶，并以接种环轻轻刮取培养基表面，获得黑曲霉分生孢子悬 浮液，并采用无菌生理盐水调节至孢子浓度为1 x 108个/mL。
[0036] 全细胞生物转化的营养液配方为：茶多酚1. 2份，磷酸氢二钾0. 4份，磷酸二氢钾 〇. 3份，氯化钠0. 3份，硫酸锰0. 7份，硫酸镁0. 03份，酵母提取物1. 2份，葡萄糖3份，121°C 灭菌30min，所述的份数为质量份数。
[0037] 全细胞生物转化的条件：温度30°C，摇床转速160r/min，时间28h。
[0038] 取色谱级甲醇与三蒸水（1 :1)将转化后的混合液稀释100倍后，采用0. 02 ym滤 膜过滤，将滤液适度稀释后直接进行HPLC检测产物浓度，结果如图3所示；从图3可以看 出，28h后，加糖转化的混合液中GA含量明显高于不加糖的混合液中GA含量，加糖的混合液 中EGC含量明显低于不加糖的混合液中EGC含量；加糖的转化混合液中EGCG并没有完全消 失，而未加糖的混合液中的EGCG已经被全部利用（见图8)。可见，加糖转化使EGCG的生物 转化出现滞后现象，但加糖能保护EGCG生物转化生成的GA不被进一步分解。
[0039] 实施例2
[0040]黑曲霉（Aspergillusniger)RAF106菌株，保藏日期为2014年8月27日，保藏编号 为CGMCC NO. 9608,保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC); 保藏单位地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号（100101)。
[0041] 黑曲霉RAF106菌株的种子培养基的配方为：市售的马铃薯蔗糖琼脂（PDA)培养 基。
[0042] 黑曲霉RAF106菌株的种子培养条件为：前子瓶静置培养，培养温度30°C，培养时 间3d。
[0043] 黑曲霉RAF106菌株的种子分生孢子的获取方法为：采用无菌生理盐水冲洗长满 黑色黑曲霉分生孢子的茄子瓶，并以接种环轻轻刮取培养基表面，获得黑曲霉分生孢子悬 浮液，并采用无菌生理盐水调节至孢子浓度为1 x 108个/mL。
[0044] 全细胞生