物转化的营养液配方为：茶多酚8份，磷酸氢二钾0. 2份，磷酸二氢钾 〇. 3份，氯化钠0. 3份，硫酸锰0. 5份，硫酸镁0. 03份，酵母提取物0. 5份，蔗糖10份，121°C 灭菌30min，所述的份数为质量份数。全细胞生物转化的条件：温度28°C，摇床转速150r/ min，时间 112h。
[0045] 取色谱级甲醇与三蒸水（1 :1)将转化后的混合液稀释100倍后，采用0.02 ym滤 膜过滤，将滤液适度稀释后直接进行HPLC检测产物浓度，结果如图4所示；从图4可以看 出，112h后，加糖的转化后混合液中GA、EGC和EC的含量明显高于不加糖的混合液中GA、 EGC和EC的含量；加糖的混合液和未加糖的混合液中的EGCG均被完全分解（见图8)。这 就说明，加糖转化能在EGCG生物转化结束之后很长的一段时间内保护生成的GA和EGC不 被进一步分解。
[0046] 实施例3
[0047] 黑曲霉（Aspergillusniger)RAF106菌株，保藏日期为2014年8月27日，保藏编号 为CGMCC NO. 9608,保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC); 保藏单位地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号（100101)。
[0048] 黑曲霉RAF106菌株的种子培养基配方为：马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂20g，蒸馏 水1000mL，pH自然，121°C灭菌15min。黑曲霉RAF106菌株的种子培养条件为：茄子瓶静置 培养，培养温度25°C，培养时间2d。
[0049] 黑曲霉RAF106菌株的种子分生孢子的获取方法为：采用无菌生理盐水冲洗长满 黑色黑曲霉分生孢子的茄子瓶，并以接种环轻轻刮取培养基表面，获得黑曲霉分生孢子悬 浮液，并采用无菌生理盐水调节至孢子浓度为1 x 108个/mL。
[0050] 全细胞生物转化的营养液配方为：EGCG5份，磷酸氢二钾0. 8份，磷酸二氢钾1份， 氯化钠0. 6份，硫酸锰0. 5份，硫酸镁0. 03份，酵母提取物2份，麦芽糖6份，121°C灭菌 30min，所述的份数为质量份数。
[0051]全细胞生物转化的条件：温度37°C，摇床转速180r/min，时间28h。
[0052] 取色谱级甲醇与三蒸水（1:1)将转化后混合液稀释100倍后，采用0.02ym滤膜 过滤，将滤液适度稀释后直接进行HPLC检测产物浓度，结果如图5所示；从图5可以看出， 转化28h时，EGCG被全部转化。从图5可见，加糖的B图中GA含量明显高于不加糖的对照 (A图），可见在转化28h，已有部分GA被利用，说明麦芽糖对GA具有保护作用。
[0053] 实施例4
[0054] 黑曲霉（Aspergillusniger)RAF106菌株，保藏日期为2014年8月27日，保藏编号 为CGMCC NO. 9608,保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC); 保藏单位地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号（100101)。
[0055] 黑曲霉RAF106菌株的种子培养基配方为：马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂20g，蒸馏 水1000mL，pH自然，121°C灭菌15min。黑曲霉RAF106菌株的种子培养条件为：茄子瓶静置 培养，培养温度25 °C，培养时间5d。
[0056] 黑曲霉RAF106菌株的种子分生孢子的获取方法为：采用无菌生理盐水冲洗长满 黑色黑曲霉分生孢子的茄子瓶，并以接种环轻轻刮取培养基表面，获得黑曲霉分生孢子悬 浮液，并采用无菌生理盐水调节至孢子浓度为1 x 108个/mL。
[0057] 全细胞生物转化的营养液配方为：EGCG 15份，磷酸氢二钾0.2份，磷酸二氢钾0.1 份，氯化钠1. 6份，硫酸锰0. 06份，硫酸镁0. 3份，麦芽提取物1. 6份，淀粉10份，121°C灭 菌30min，所述的份数为质量份数。
[0058]全细胞生物转化的条件：温度28°C，摇床转速180r/min，时间90h。
[0059] 取色谱级甲醇与三蒸水（1:1)将转化后混合液稀释100倍后，采用0.02ym滤膜 过滤，将滤液适度稀释后直接进行HPLC检测产物浓度，结果如图6所示；从图6可以看出， 转化90h时，EGCG已经被全部转化，图6 (A)所示，营养液中不加糖，GA会被进一步转化利 用，在90h时加糖后的混合液中GA含量（图6(B))远远高于不加糖的对照。
[0060] 实施例5
[0061] 单宁酶粗酶液的提取：取发酵茶汤100mL经滤纸抽滤后得到菌丝，然后用蒸馏水 冲洗菌丝数次，然后置于0. lmol/L的pH5. 0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中漂洗，抽滤去掉 多余水分，置于冰箱中预冷，备用。取lg石英砂，6mL缓冲溶液于4°C预冷的研钵中，加入 菌丝，在冰浴上快速研磨成衆，于4°C、10000r/min离心15min，取上清液用缓冲溶液定容至 10mL，即得胞内单宁酶粗酶液。
[0062] 单宁酶酶活的测定：取5支10mL试管分别编号为1支对照管（1号）、1支空白管 (2号）和3支测定管（3、4和5号）。在每支管中加入0? 2mL的酶液，于40°C预热10min。 在对照管中加入0. 6mL无水乙醇（灭酶活），在空白管中加入0. 2mL的缓冲液，在对照管和 测定管中均加入〇. 2mL浓度为2X l(T3m〇l/L的没食子酸丙酯溶液，40°C反应20min，除对照 外，其余各管加入〇. 6mL无水乙醇，再用缓冲溶液定容至10mL，于270nm测定吸光值A。
[0063]酶活定义：在40°C，酶液每分钟使没食子酸丙酯分解，导致A27tol减少0. 001个吸 光值的酶活力定义为一个酶活单位（U)。
[0064]酶活计算公式：酶活（U/100mL) =AA27QX 5X10X1000/20
[0065] = 250 X A A270
[0066] 在3%的茶汤中分别添加6%的葡萄糖、木糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、淀粉、甘露醇和 0 -环化糊精制备含有不同糖的茶汤培养基，不添加糖的茶汤作为空白对照。在茶汤培养 基中接种浓度2. 25X 106个/mL的RAF106孢子悬浮液lmL，于25°C、130r/min条件下发酵 36h。发酵结束后，分别测定RAF106胞内单宁酶酶活，结果如图7和图8所示；从图7(注： 用Duncan法进行多重比较。柱形图标有不同大写字母、小写字母者分别表示组间差异极显 著（p < 0. 01)和显著（p < 0. 05)，标有相同小写字母者表示组间差异不显著（p > 0. 05); I土ST,n = 3)可以看出，不同的糖对黑曲霉RAF106产单宁酶的酶活力影响效果不同，但是对 单宁酶活力都有显著降低的作用。
[0067] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种防止表没食子儿茶素和没食子酸被转化的方法，其特征在于，采用黑曲霉 (Aspergillusniger)RAF106菌株进行全细胞生物转化，全细胞生物转化的营养液中加入质 量份数2~10份糖用以阻止表没食子儿茶素和没食子酸被进一步转化。
2. 根据权利要求1所述的防止表没食子儿茶素和没食子酸被转化的方法，其特征在 于，所述的黑曲霉（Aspergillusniger)RAF106菌株，保藏日期为2014年8月27日，保 藏编号为CGMCC NO. 9608,保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC);保藏单位地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
3. 根据权利要求1所述的防止表没食子儿茶素和没食子酸被转化的方法，其特征在 于，所述的黑曲霉（Aspergillusniger)RAF106菌株应用种子培养基进行种子培养，获得黑 曲霉RAF106菌株的种子分生孢子； 所述的种子培养基的配方为：马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH自 然，121°C灭菌 20min。
4. 根据权利要求3所述的防止表没食子儿茶素和没食子酸被转化的方法，其特征在 于，所述的种子培养的条件为：前子瓶静置培养，培养温度28~35°C，培养时间3~5d。
5. 根据权利要求3所述的防止表没食子儿茶素和没食子酸被转化的方法，其特征在 于，在所述的种子培养过程中，黑曲霉RAF106菌株的种子菌接种量为每毫升全细胞生物转 化的营养液接种1〇 2~10 8个黑曲霉RAF106菌株分生孢子。
6. 根据权利要求3所述的防止表没食子儿茶素和没食子酸被转化的方法，其特征在 于，所述的黑曲霉RAF106菌株的种子分生孢子的获取方法为：采用无菌生理盐水冲洗长满 黑色黑曲霉分生孢子的茄子瓶，并以接种环轻轻刮取种子培养基表面，得到黑曲霉分生孢 子悬浮液。
7. 根据权利要求1所述的防止表没食子儿茶素和没食子酸被转化的方法，其特征 在于，所述的全细胞生物转化的营养液的配方为：茶多酚或EGCG 1~20份，磷酸氢二钾 0. 03~0. 8份，磷酸二氢钾0. 1~3份，硫酸锰0. 03~0. 7份，氯化钠0. 3~2份，硫酸镁 0. 01~0. 3份，酵母或麦芽提取物0. 02~2份，糖2~10份；121°C灭菌30min ;所述的份 数为质量份数。
8. 根据权利要求7所述的防止表没食子儿茶素和没食子酸被转化的方法，其特征在 于，所述的糖为葡萄糖、蔗糖、淀粉、0 -环化糊精、乳糖、甘露糖、麦芽糖、木糖、核糖、阿拉伯 糖、半乳糖、果糖、海藻糖、纤维二糖、土豆汁、豆芽汁和麦麸中的一种或者至少两种混合物。
9. 根据权利要求1所述的防止表没食子儿茶素和没食子酸被转化的方法，其特征在 于，所述的全细胞生物转化的条件为：温度25~42°C，摇床转速160~220r/min，时间20~ 60h〇
10. 根据权利要求1所述的防止表没食子儿茶素和没食子酸被转化的方法，其特征在 于，黑曲霉全细胞生物转化茶多酚或EGCG连续反应60~112小时，表没食子儿茶素和没食 子酸仍然不被进一步转化。
【专利摘要】本发明公开了一种防止表没食子儿茶素和没食子酸被转化的方法。该方法采用黑曲霉进行全细胞生物转化，全细胞生物转化的营养液中加入质量份数2～10份糖；黑曲霉RAF106菌株的保藏编号为CGMCC NO.9608。全细胞生物转化的营养液的配方为：茶多酚或EGCG 1～20份，磷酸氢二钾0.03～0.8份，磷酸二氢钾0.1～3份，硫酸锰0.03～0.7份，氯化钠0.3～2份，硫酸镁0.01～0.3份，酵母或麦芽提取物0.02～2份，糖2～10份。本发明通过在营养液中加入蔗糖等碳水化合物，可防止非酯型儿茶素和没食子酸被进一步转化，提高了表没食子儿茶素和没食子酸的得率。CGMCC No.960820140827
【IPC分类】C12R1-685, C12P17-06, C12P7-42
【公开号】CN104673844
【申请号】CN201510084979
【发明人】方祥
【申请人】华南农业大学
【公开日】2015年6月3日
【申请日】2015年2月15日