一种食品级高含量茶黄素类物质的制备方法与流程

本发明属于植物活性成分提取技术领域，具体涉及一种食品级高含量茶黄素类物质的制备方法。

背景技术：

茶黄素类化合物是儿茶素类物质的氧化聚合物产物，是红茶的重要品质成分，一般占红茶干物重的0.5～2％。目前已发现的茶黄素类衍生物有20多种，其中主要有四种，分别为茶黄素(TF)、茶黄素-3-没食子酸酯(TF-3-G)、茶黄素-3′-没食子酸酯(TF-3′-G)及茶黄素-3，3′-双没食子酸酯(TFDG)。大量研究表明茶黄素类化合物具有多种药理功能如抗氧化、防癌抗癌、抗炎、降血糖、降血脂及减肥等功效，其中TFDG的作用最强。

目前，现有的茶黄素类化合物的制备一般包括合成和分离，其中，应用大孔树脂(如NKA、AB-8、D101等)分离茶黄素类混合物已取得很大进展，因此，如何提高茶黄素类物质合成的产率(或儿茶素类转化率)是目前研究的重点。茶黄素类物质合成的方法主要包括化学合成法和酶法合成，由于前者会影响产品质量和安全性，并且反应难控制，产率低，其应用前景受到限制，酶法合成自然成了首选，但是目前的酶法合成也存在一定的缺陷：首先，它们均为单次反应，造成大量未反应儿茶素类物质的浪费，降低儿茶素类物质的利用率；其次，现有儿茶素类酶法合成茶黄素类化合物的氧化反应体系并非最佳，有待进一步改进；另外，目前普遍采用乙酸乙酯萃取发酵液中的茶黄素类物质，不但没有解决儿茶素类化合物转化率低的缺点(或茶黄素类产率低)，还降低了产品的安全性，增加了萃取、浓缩步骤，增加能耗；最后，目前酶法合成的茶黄素物质中生物活性最强的TFDG含量少，降低了茶黄素类化合物的药用价值。

因此，目前急需一种能提高茶黄素类物质合成产率(或儿茶素类转化率)并能提高产品安全性的有效方法。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种食品级高含量茶黄素类物质的制备方法。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、一种食品级高含量茶黄素类物质的制备方法，具体包括以下步骤：

(1)将茶鲜叶加入含乙醇缓冲液中匀浆，过滤后向滤液中加入儿茶素类物质，通氧发酵制得发酵液1；

(2)将步骤(1)中制得的发酵液1上大孔树脂吸附完成后，用步骤(1)中所述含乙醇缓冲液进行洗脱，洗脱体积为0.3～1.0BV；所述发酵液1上大孔树脂吸附过程中待流出液中出现所述儿茶素类物质时开始收集所述流出液至所述洗脱完毕，获得收集液1；

(3)将茶鲜叶加入步骤(2)中制得的收集液1中匀浆，过滤后滤液通氧发酵，制得发酵液2；

(4)将步骤(3)中制得的发酵液2上步骤(2)中的大孔树脂吸附完成后，用步骤(1)中所述含乙醇缓冲液洗脱，洗脱体积为0.3～1.0BV；所述发酵液2上大孔树脂吸附过程中待流出液中出现所述儿茶素类物质时开始收集所述流出液至所述洗脱完毕，获得收集液2；

(5)重复步骤(3)、步骤(4)，待最后一次发酵液上大孔树脂吸附完成后，分别用纯净水、体积百分比为20～30％和60～80％乙醇水溶液洗脱，收集60～80％乙醇洗脱液，浓缩，干燥，制得茶黄素类物质。

进一步，步骤(1)中，所述茶鲜叶与含乙醇缓冲液的料液比(g/ml)为3:4～7.5；所述茶鲜叶与儿茶素类物质的质量比为30～50:1。

进一步，步骤(1)中，所述含乙醇缓冲液为乙醇-磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，pH值为5～6，其中乙醇的体积百分比为10～30％。

进一步，步骤(1)及步骤(3)中，所述通氧发酵具体为30～35℃条件下通入氧气，自然发酵50～60min。

进一步，步骤(2)中，所述大孔树脂为NKA-9树脂或AB-8树脂。

进一步，步骤(3)中，所述茶鲜叶与步骤(2)中所述收集液1的料液比(g/ml)为3:8～15。

进一步，步骤(2)及步骤(4)中，所述吸附速率与洗脱速率为0.8～1.2BV/h；所述收集液1和收集液2的体积为0.8～1.5BV。

进一步，步骤(5)中，所述重复的次数根据每100ml大孔树脂茶鲜叶的添加总量为80～100g而定。

进一步，步骤(5)中，所述纯净水洗脱，洗脱体积为5BV，洗脱速率为1.5-2BV/h。

进一步，步骤(5)中，分别用所述体积百分比为20～30％和60～80％乙醇水溶液洗脱，洗脱体积为2BV，洗脱速率为1.5～2BV/h。

本发明的有益效果在于：本发明提供了一种食品级高含量茶黄素类物质的制备方法，该方法利用合成-分离联合工艺确保未反应的儿茶素类物质重复反应，极大地提高了儿茶素类物质的转化率，成本低廉，可操作性强，易于工业化，工艺过程绿色环保，产品不存在有机溶剂超标等安全隐患。具有包括以下优点：(1)直接采用茶鲜叶作为酶源，不仅能提供多酚氧化酶，还能提供底物，降低外源儿茶素类物质的使用量，同时提高合成的茶黄素类物质中TFDG的量高；(2)缓冲液中加入体积百分比为10～30％的乙醇一方面可以提高多酚氧化酶的活性，提高儿茶素类物质的转化率，另一方面可以将未反应的儿茶素类物质洗脱下来进行重复反应，进一步提高儿茶素类物质的利用率及转化率，且洗脱过程中茶黄素类物质基本不受影响；(3)发酵完成后采用连续过柱工艺，避免使用乙酸乙酯萃取及浓缩步骤导致的反应无法重复进行，提高儿茶素类物质的转化率，也能提高产品的质量及安全性并有效降低成本。另外，大孔树脂吸附茶黄素类物质后，也能有效防止目标产物的进一步氧化。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为实施例1制得的茶黄素类物质的高效液相色谱图。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

实施例1

(1)称取180g茶鲜叶加入450ml pH5.0的15％乙醇-磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液匀浆，过滤后向滤液中加入6g儿茶素类物质，通入氧气，30℃下自然发酵60min，制得发酵液1；

(2)将步骤(1)中制得的发酵液1以1BV/h的流速通过300ml NKA-9大孔树脂，然后用0.5BV步骤(1)中的缓冲液以1BV/h的流速进行洗脱，发酵液1上大孔树脂吸附过程中待流出液遇质量分数为2％的三氯化铁变蓝后开始收集流出液至洗脱完毕，获得收集液1；

(3)称取90g茶鲜叶加入450ml步骤(2)中制得的收集液1中匀浆，过滤后，滤液通入氧气，30℃下自然发酵60min，制得最终发酵液，将最终发酵液以1BV/h的流速通过步骤

(2)中300ml NKA-9大孔树脂后，先用5BV的纯净水以1.5BV/h的流速进行洗脱，再分别用2BV体积百分比为30％和60％乙醇水溶液以1.5BV/h的流速进行洗脱，收集60％乙醇洗脱液，浓缩，干燥，制得茶黄素类物质，60％乙醇水溶液洗脱液的茶黄素类纯度为55.9％，茶黄素类物质产率为29.2％。

图1为上述方法制备的茶黄素类物质的高效液相色谱图，由图可知，四种茶黄素类物质含量为55.9％，其中TFDG的含量最高，进一步说明以本发明的方法能够制备出TFDG含量高的茶黄素类物质。

实施例2

乙醇-磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中乙醇的体积百分比为25％，指示剂为1％的铁氰化钾溶液，其他条件与实施例1相同，60％乙醇水洗脱液的茶黄素类纯度为55.3％，茶黄素类物质产率为28.5％。

实施例3

采用的缓冲液为磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，其他条件与实施例1相同，60％乙醇水洗脱液的茶黄素类纯度为49.4％，茶黄素类物质产率为15.1％。

本发明中，所用到的材料及试剂均为食品级。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。