没食子酸乙酯在治疗骨肉瘤方面的新用图
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种没食子酸乙酯的药物应用，尤其是在治疗U2-0S型骨肉瘤作用的药物的用途。
【背景技术】
[0002]骨肉瘤(Osteosarcoma)是起源于骨骼的恶性肿瘤，其发病率在原发性骨恶性肿瘤中占居首位。骨肉瘤患者中75%为青少年，男性患者是女性患者的1.5倍，其恶性程度甚高，容易发生早期肺转移，预后极差，既往一经发现多采取截肢手术治疗，即便如此，患者术后5年存活率也仅为5-20%，这为患者及其家庭带来极大的精神伤害，也为社会乃至国家都带来沉重的经济负担。目前保肢手术辅以大剂量化疗逐步成为骨肉瘤的首选治疗方案，但仍有20-40%患者死于转移。
[0003]在前期研究中，我们从二色补血草中分离得到了没食子酸乙酯，其又称3，4，5-三羟基苯甲酸乙酯，英文名称是Ethyl gallate，除了存在于二色补血草中，很多植物如狼毒大戟，赤芍，翻白草，亮叶围涎树，美丽芍药，南天竹种子，芡实，中华补血草，泽漆，窄叶芍药以及鸡尾木等植物中也发现了其的存在。它不仅以天然产物形式存在于多种植物中，也可以方便的被合成。
[0004]没食子酸乙酯除了用作油脂的抗氧化剂、食品添加剂及某些药品的中间体，还发现对小鼠肾上腺嗜铬瘤细胞株PC12有一定的抑制作用，对结肠癌L0V0细胞、肺癌A549细胞、口腔鳞癌CAL-27细胞的生长均具有一定的抑制作用，体外可显著抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞的侵袭、运动以及黏附能力，对过氧化氢造模的人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y的氧化损伤模型，具有一定的保护作用。
[0005]尽管没食子酸乙酯的作用陆续被研究学者发现，但其在治疗骨肉瘤，特别是U2-0S型骨肉瘤方面的研究仍未见报道。
【发明内容】
[0006]本发明旨在提供一种没食子酸乙酯的新的药物应用用途，尤其是在治疗U2-0S型骨肉瘤作用的药物的用途。
[0007]本发明中所用PBS缓冲液配制方法如下:8 gNaCl,0.2 gKCl，1.44 gNa2HP04，0.20gKH2P04，加超纯水至1000 mL，调节PH7.2-7.4，高压高温(121 °C )灭菌20min，4°C冷藏备用。
[0008]本发明中所用胰酶配制方法如下:称取胰蛋白酶粉0.50 g和EDTA 1 g，溶于200mL PBS缓冲液中。低温下搅拌4 h，充分溶解后，调整PH 7.2-7.4。0.22 μ m滤膜过滤除菌，用15 mL试管分装，-20°C冻存备用。
[0009]本发明中所用RPMI1640培养基配制方法如下:将RPMI Medium 1640固体粉末培养基6.75 g溶于500 mL超纯水中，加入32.5 mg青霉素、50 mg链霉素、1 g NaHC03，充分溶解；0.22 μπι滤膜过滤除菌，在超净工作台内向100mL瓶分装，每瓶85 mL，4°C冷藏备用。使用时每瓶加入10 mL马血清、5 mL胎牛血清，配置成15%培养基。
[0010]本发明中所用MTT配制方法如下:称取20 mg MTT于5 mL试管中，加入4 mL PBS缓冲液，使用涡旋仪使其完全溶解，即成5 mg/mL MTT液；用0.22 Mm微孔滤器除菌后_20°C冷冻保存。
[0011]本发明中所用酸液配制方法如下:称取120 g重铬酸钾加入1000 mL超纯水中，加热辅助使其完全溶解；将该溶解液缓慢加入200 mL浓硫酸中，并不断搅拌，至其冷却。
[0012]本发明的步骤如下:
1、细胞株复苏:在敞口瓶中加入蒸馏水，放入38°C恒温水槽中，待其温度恒定后将冻存于-198°C液氮中的细胞取出，快速放入敞口瓶中，晃动，使冻存管内液体于1-2 min内溶化。用酒精棉擦拭冻存管，放入工作台内，将细胞液吸入15 mL试管内，同时加入10 mL该细胞株的新鲜培养基，1000 rpm离心4 min。弃去上清液，移液枪注入1 mL新鲜培养基吹打分散后，注入已装有7 mL新鲜培养基的培养瓶内，轻旋盖子，于0)2培养箱内培养。
[0013]2、细胞换液:将细胞培养瓶抒紧盖子后从培养箱中拿出，观察瓶内培养基的颜色及是否浑浊，于倒置显微镜下观察细胞生长状况。用酒精棉将培养瓶擦拭后放入超净工作台，取下盖子，倒掉培养基。用移液枪吸取2 mL PBS打入培养瓶内，盖上盖子后，晃动几次，倒掉PBS，重复此操作一次。用移液枪吸取8 mL新鲜培养基注入培养瓶内，盖上盖子，观察细胞状态。酒精擦拭瓶身及瓶口后放入培养箱内。
[0014]3、细胞消化:将细胞培养瓶抒紧盖子后从培养箱中拿出，观察瓶内培养基的颜色及是否浑浊，于倒置显微镜下观察细胞生长状况。用酒精棉将培养瓶擦拭后放入超净工作台，取下盖子，倒掉培养基。用加样器吸取2 mL PBS打入培养瓶内，盖上盖子后，晃动几次后，倒掉PBS，重复此操作一次。用移液枪吸取1 mL胰酶，注入培养瓶内，旋紧盖子，平放培养瓶使胰酶均能浸润培养面。于倒置显微镜下观察，细胞变成单个圆形，则需要终止胰酶的消化。酒精棉擦拭后放入超净工作台，移液管吸取1 mL新鲜培养基打入培养瓶中，用移液枪吸取培养瓶内液体吹打培养瓶的细胞培养面，液体变成浑浊状态。将该消化后液体移入10 mL试管中，旋紧盖子，1000 rpm离心4 min，弃去上清液。用移液枪吸取2 mL PBS注入试管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液。
[0015]4、细胞传代:将消化好的细胞用移液枪注入2 mL新鲜培养基，并吹打分散后，分别吸取1 mL液体移入已装有7 mL新鲜培养基的培养瓶中，旋紧盖子，放入C02培养箱中培养。
[0016]5、细胞计数:将上述消化好的细胞，用移液枪注入4 mL新鲜培养基，并吹打分散，吸取细胞悬液少许，滴加在盖玻片边缘，使悬液充满盖玻片和计数板之间。静置几分钟后，于倒置显微镜下观察，计数细胞板中四个大格细胞总数。
[0017]计数原则:以细胞格线为准。记上不记下，计左不计右。
[0018]计算公式:细胞数/mL=四大格细胞总数/4 X 104个。
[0019]6、MTT测定法:实验前先将96孔板于超净工作台中，紫外灯照射3h。将上述已经细胞计数的细胞悬液，加入一定的培养基稀释，调整细胞浓度为5000个/100 μ Lo用移液枪吸取200 uL的细胞悬液于96孔板的孔中，其中96孔板的四周不加，只加中间的6行10列，共60个孔。96孔板的四周加入PBS缓冲液，防止边缘效应。盖上盖子，并记录日期和时间，酒精喷板后，放入培养箱中培养。
[0020]培养12 h后于倒置显微镜下观察，细胞贴壁后，酒精喷板，放入超净工作台中，用200 移液枪将孔内的培养基吸出，加入不同浓度的含药物的培养基培养，每孔200 ^Lo盖上盖子，于倒置显微镜下观察，酒精喷板，放入培养箱中。
[0021]培养24、48 h、60或72小时后于超净工作台中每孔加入10 MTT，盖上盖子，酒精喷板后放入培养箱中培养。4 h后用移液枪吸出孔内液体，每孔加入150 uL DMS0，振摇均匀后，放入酶标仪中，570 nm下读数。
[0022]7、计算公式:肿瘤细胞生长抑制率％ = (0D对照-0D样品)/0D对照X 100 %
8、实验模型设置:实验组:将试验药物用DMS0溶解，然后用培养基稀释使DMS0最终浓度为0.5%。每个单体化合物设三个剂量组，每个计量样品做3个孔的平行实验。空白实验组:只含有培养基，每块96孔板中留有3个孔的平行实验。阳性对照组:含有一定浓度阳性药物5-氟尿嘧啶(5-FU)的培养基，每块96孔板中有3个孔的平行实验。阴性对照组:含有0.5%DMS0的培养基，每个样品做3个孔的平行实验。
【具体实施方式】
[0023]下面结合实施例，对本发明进一步进行描述，但其不代表为本发明的唯一实施方式。
[0024]实施例1:经过复苏的U2-0S型骨肉瘤细胞株，在培养过程中，根据需要进行细胞换液，在细胞贴壁生长面积达到细胞瓶底部的80%后，倒掉培养基，用加样器吸取2 mL PBS打入培养瓶内，盖上盖子后，晃动几次后，倒掉PBS，重复此操作一次。用移液枪吸取1 mL胰酶，注入培养瓶内，旋紧盖子，平放培养瓶使胰酶均能浸润培养面。于倒置显微镜下观察，细胞变成单个圆形，则需要终止胰酶的消化。酒精棉擦拭后放入超净工作台，移液管吸取1mL新鲜培养基打入培养瓶中，用移液枪吸取培养瓶内液体吹打培养瓶的细胞培养面，液体变成浑浊状态。将该消化后液体移入10 mL试管中，旋紧盖子，1000 rpm离心4 min，弃去上清液。用移液枪吸取2 mL PBS注入试管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，进行细胞传代，将消化好的细胞用移液枪注入2 mL新鲜培养基，并吹打分散后，分别吸取1 mL液体移入已装有7 mL新鲜培养基的培养瓶中，旋紧盖子，放入0)2培养箱中培养。经传代后的细胞，倒掉培养基，用加样器吸取2 mL PBS打入培养瓶内，盖上盖子后，晃动几次后，倒掉PBS，重复此操作一次。用移液枪吸取1 mL胰酶，注入培养瓶内，旋紧盖子，平放培养瓶使胰酶均能浸润培养面。于倒置显微镜下观察，细胞变成单个圆形，则需要终止胰酶的消化。酒精棉擦拭后放入超净工作台，移液管吸取1 mL新鲜培养基打入培养瓶中，用移液枪吸取培养瓶内液体吹打培养瓶的细胞培养面，液体变成浑浊状态。将上述消化好的细胞，用新鲜培养基稀释，并吹打分散，吸取细胞悬液少许，滴加在盖玻片边缘，使悬液充满盖玻片和计数板之间。静置几分钟后，于倒置显微镜下观察，计数细胞板中四个大格细胞总数。调整细胞浓度为5000个/100 μ L。用移液枪吸取200 的细胞悬液于96孔板的孔中，其中96孔板的四周不加，只加中间的6行10列，共60个孔。96孔板的四周加入PBS缓冲液，防止边缘效应。盖上盖子，并记录日期和时间，酒精喷板后，放入培养箱中培养。培养12 h后于倒置显微镜下观察，细胞贴壁后，酒精喷板，放入超净工作台中，用200 移液枪将孔内的培养基吸出，加入100 Mg.mL \20 Mg.mL \4 μ g.mL 1的含药物的培养基培养，每孔200^Lo盖上盖子，于倒置显微镜下观察，酒精喷板，放入培养箱中。培养24h后于超净工作台中每孔加入10 uL MTT，盖上盖子，酒精喷板后放入培养箱中培养。4 h后用移液枪吸出孔内液体，每孔加入150 Ml DM