专利名称：北沙参总木酯素及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，涉及从中药材中提取有效成分的方法，具体而言，是一种从北沙参中制备木酯素类成分的方法。本发明还涉及北沙参总木酯素保护脑功能、增强学习记忆、治疗老年性痴呆等医药用途。
背景技术：
北沙参为常用滋阴补虚中药。其主要产地为山东莱阳和内蒙赤峰，传统的药材加工处理方法是在夏秋两季采挖后，除去须根，洗净，稍晾，置沸水中烫后除去外皮待用。我们前期研究表明，北沙参含有多种二芳基丁烷型木脂素和8-O-4’型异木脂素类成分，如可来灵素A、B、C、D、E、F(glehlinoside A、B、C、D、E、F)等(Chem.Pharm.Bull.，2002，50(1)73-77；Chin Chem Lett.2008，19(12)1459-1461；药学学报，2007，42(10)1070-1073)。
为了研制具有保护脑功能、增强学习记忆、治疗老年性痴呆的新药，发明人在前期对北沙参化学成分系统研究的基础上，首次提供了一种科学稳定，制备工艺简单，适合工业化生产特点的北沙参总木酯素的制备方法。对该提取物的进一步研究，发现其具有抗氧化作用，对自由基诱导的鼠脑乙酰胆碱酯酶抑制的保护作用，以及脯氨酰寡肽酶抑作用等生物活性。行为学动物实验表明，该提取物能够显著提高模型动物学习记忆能力。
存在于人体内的自由基及其他一些氧化物，可加速机体的衰老，且有可能诱发健忘、老年性痴呆(Alzheimer’s disease)等疾病.它们可对生物分子如蛋白质，磷脂等产生氧化性破坏，进而引发疾病。近来研究表明，自由基可致脑内乙酰胆碱酯酶的活力降低，特别表现在老年性痴呆患者。脯氨酰寡肽酶是一种特异性的神经肽酶，在与记忆相关的海马区中，呈非常强的活性。脯氨酰寡肽酶特异性地在脯氨酸的羧基末端水解小分子量多肽，许多作为神经递质的神经肽类物质含有脯氨酰基，如P物质以及缓激肽等很容易被POP降解，从而影响到这些神经递质及其代谢物对学习和记忆行为所起的调节作用。研究表明，在老年痴呆的病人中，脯氨酰寡肽酶的活性有明显增加。
因此，该提取物具有作用物质基础和作用机理明确的特点。目前，尚未见有关北沙参总木酯素制备方法，以及相类似的二芳基丁烷型木脂素(结构如通式一)或8-O-4’型异木脂素(结构如通式二)制备方法的报道；也为见该类型木酯素在保护脑功能、增强学习记忆、治疗老年性痴呆中应用的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种科学稳定的，工艺简便，适用于工业化生产的含有北沙参木酯素类活性成分的提取物的制备方法，并明确提出了其保护脑功能、提高学习记忆的医药用途。
本发明中北沙参总木酯素包括具有如下通式的化合物
式中R1是氢或甲氧基，R2是氢或阿魏酰基、咖啡酰基、香草酰基等。
式中R1是羟基或羧基，R2是氢或阿魏酰基、咖啡酰基、香草酰基等。
北沙参总木酯素的制备方法是通过如下方法实现的 北沙参粗粉，经乙醇提取，大孔吸附树脂吸附，用水洗去杂质，用乙醇液洗脱，回收溶剂，所得浸膏，用乙酸乙酯萃取，回收溶剂而得到。其包括如下3步骤 A、醇提未经产地加工的北沙参干燥药材，粉碎成粗粉。粗粉加6-7倍量的70-75％乙醇浸泡，加热回流提取，每次1.5-2小时，提取2-3次，合并各次提取液，减压浓缩至50℃时浓缩液相对密度为1.20-1.30。
B、大孔树脂吸附A步所得浓缩液经D101型或Diaion HP-20型大孔吸附树脂吸附，上样量与树脂用量的比例为1∶5-1∶6，用稀醇(0-5％)洗去杂质，再用75-85％醇液洗脱得醇溶液，回收溶剂得浸膏。
C、除杂B步所得浸膏混悬于水中，加入等体积乙酸乙酯，萃取3-4次，减压回收溶剂，合并萃取物，得到北沙参总木酯素类成分。
进一步，该提取物经反复的Sephadex LH-20柱色谱及反相ODS柱色谱，水-甲醇混合溶剂梯度洗脱，得到8个木酯素或异木酯素类化合物，经理化方法和核磁共振谱学分析，确定了它们的结构，分别为可来灵素A、B、C、D、E、F(glehlinoside A、B、C、D、E、F)，橙皮素A(cirtrusin A)，以及(-)-secoisolariciresinol 4-O-β-D-glucopyranoside。发明人已经在前期有关北沙参化学成分的基础研究工作中，阐明并报道了上述化合物的结构，同时制备了这些单体化合物作为化学对照品，可用于该提取物的质量分析研究。
药效实验表明，北沙参总木酯素对自由基诱导的鼠脑乙酰胆碱酯酶抑制具有保护作用，并且能够选择性地抑制脯氨酰寡肽酶的活性，能够显著提高模型动物学习记忆能力，为其临床应用提供了科学依据，有望成为改善学习记忆障碍和治疗老年痴呆的药物。
综上所述，本发明是在发明人前期对北沙参化学成分及生物活性的系统研究基础上，首次提供了一种科学稳定，制备工艺简单，纯度高，适合工业化生产的北沙参总木酯素的制备方法。该提取物具有作用物质基础和作用机理明确的特点，可作为保护脑功能、提高学习记忆、和治疗老年性痴呆的药物的原料，与药学上可接受的载体混合，按常规工艺制成片剂、胶囊剂、颗粒剂或复方制剂。目前，尚未见有关北沙参总木酯素制备方法，以及相类似的二芳基丁烷型木脂素或8-O-4’型异木脂素制备方法的报道；也为见该类型木酯素在保护脑功能、增强学习记忆、治疗老年性痴呆中应用的报道。
具体实施例方式 以下通过具体实施例来进一步说明本发明，实施例仅用于说明，不能限制本发明的范围。
实施例1 取北沙参粗粉1kg，加6000ml的75％乙醇浸泡，加热回流提取3次，提取时间分别为2、2、1小时，合并水提取液，滤过，60℃减压浓缩至相对密度为1.20(50℃)，得浓缩液(200ml)；经Diaion HP-20型大孔吸附树脂吸附，树脂用量1kg，用2000ml水洗去杂质，再用4000ml 85％乙醇液洗脱，收集醇洗脱液，减压回收溶剂，所得浸膏混悬于150ml水中，加入等体积乙酸乙酯，萃取3次，减压回收溶剂，得到该提取物3.3g。
实施例2 取北沙参粗粉5kg，加25000ml的70％乙醇浸泡，加热回流提取2次，提取时间分别为2、2小时，合并提取液，滤过，60℃减压浓缩至相对密度为1.30(50℃)，得浓缩液(1000ml)；经D101型大孔吸附树脂吸附，树脂用量6kg，用8000ml水洗去杂质，再用20000ml的75％乙醇液洗脱，收集醇洗脱液，减压回收溶剂，所得浸膏混悬于200ml水中，加入等体积乙酸乙酯，萃取3次，减压回收溶剂，得到该提取物11.5g。
实施例3 北沙参总木酯素中化学成分的分离 取北沙参总木酯素(18g)经硅胶柱色谱，用氯仿-甲醇系统(100∶0→0∶100)梯度洗脱，得到氯仿洗脱流分(Fr.1，0.8g)，95％氯仿洗脱流分(Fr.2，0.6g)，90％氯仿洗脱流分(Fr.3，8.5g)，85％氯仿洗脱流分(Fr.4，4.5g)，甲醇洗脱流分(Fr.5，0.5g)。
Fr.3(7.5g)经Sephadex LH-20柱色谱，H2O-MeOH系统(80∶20→30∶70)梯度洗脱，50％甲醇洗脱流分经ODS柱色谱，H2O-MeOH系统(90∶10→30∶70)梯度洗脱，得到化合物1(350mg)，2(70mg)；70％甲醇洗脱流分经ODS柱色谱，H2O-MeOH系统(90∶10→30∶70)梯度洗脱，得到化合物4(280mg)，5(220mg)，6(50mg)。
Fr.4(4.3g)经Sephadex LH-20柱色谱，H2O-MeOH(90∶10→20∶80)梯度洗脱，50％甲醇洗脱流分经ODS柱色谱，H2O-MeOH系统(50∶50→20∶80)梯度洗脱，得到化合物3(170mg)。70％甲醇洗脱流分经ODS柱色谱，H2O-MeOH系统(20∶80→30∶70)梯度洗脱，得到化合物7(200mg)，8(350mg)。
实施例4 北沙参总木酯素对自由基诱导的鼠脑乙酰胆碱酯酶抑制的保护作用 (1)实验材料 动物雄性Wister大鼠(200±2g)2只，实验前禁食24小时，自由饮水。
试剂50mM Tris-HCl缓冲盐(pH 7.4)和300mM蔗糖的混合溶液，83.3mM Tris-HCl缓冲盐(pH 8.0)和240mM蔗糖的混合溶液、120mM NaCl溶液，0.84mM FeSO4溶液，4mM抗坏血酸溶液。ACHE测定试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号20060303)，双缩脲总蛋白测定试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号20060306)。
材料与仪器721E可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司)，TGL-16高速台式冷冻离心机(湖南湘仪仪器有限公司)，电热恒温水浴箱(天津市泰斯特仪器有限公司)，微量可移移液器，玻璃匀浆器，10mL，5mL离心管等。
(2)实验方法 取正常雄性大鼠脑组织，放入玻璃皿中，用冰冷的生理盐水漂洗，除去血液，用滤纸拭干，精密称重，用眼科剪将组织块尽量剪碎，按重量体积比1∶9加入50mM Tris-HCl缓冲盐(pH 7.4)和300mM蔗糖的混合溶液，冰浴匀浆，制成10％的脑组织匀浆。然后在4℃、3500×g的条件下离心10min，取组织匀浆上清液待测。蛋白含量采用双缩脲法测定，大鼠脑匀浆总蛋白含量为5.56mg/ml。
依次往10ml的离心管中加入0.6ml的83.3mM Tris-HCl缓冲盐(pH8.0)和240mM蔗糖的混合溶液，2mM NaCl溶液，14μl脑组织匀浆上清液，37℃预孵育60min，继续加入0.1ml 0.84mM FeSO4溶液，0.1ml的4mM抗坏血酸溶液，0.2ml的样品溶液，37℃孵育2.5h，乙酰胆碱酯酶(AchE)活性依据AchE测定试剂盒说明检测，在412nm处测定吸光度值A。以上每加一次试剂均需混匀。既加样品溶液又加FeSO4溶液、抗坏血酸溶液的为样品管；只加FeSO4溶液、抗坏血酸溶液的为损伤管；未损伤管两者均不加。每份样品平行测定3次，取平均值计算鼠脑乙酰胆碱酯酶抑制的保护率P。计算公式如下 Protecting(％)＝[A(样品)-A(损伤)]/[A(未损伤)-A(损伤)]×100％ (3)实验结果 北沙参总木酯素在100μg/ml的浓度，对自由基诱导的鼠脑乙酰胆碱酯酶抑制的保护率为95.7％，说明其具有很强的抗氧化和保护脑功能的作用。
实施例5 北沙参总木酯素对脯氨酰寡肽酶的抑制作用 (1)试验材料 试剂底物Z-Gly-Pro-AMC(瑞士Bachem化学公司)，1，4-二氧六环(天津市博迪化工有限公司，批号20070830)，双缩脲试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号20080703)，杆菌肽(北京经科宏达生物技术有限公司CODE020-07702)，0.1M Na-K+磷酸盐缓冲液(pH＝7.0)，1M醋酸盐缓冲液(pH＝4.2)。
材料与仪器721E可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司)，岛津 RF-5301PC荧光分光光度仪，玻璃匀浆器，TGL-16高速台式冷冻离心机，微量移液器，DK-98-1型恒温水浴锅，DLSB-5/20型冷阱。
(2)实验方法 取健康猪脑组织，在冰台上，加入脑重3倍体积的0.1M Na-K+磷酸盐缓冲液(pH＝7.0)。然后在匀浆器中冰浴匀浆。将上述制好的匀浆，在4℃、10000×g的条件下离心20min，取上清待测。
取上述制得的上清夜10μl，加入460μl的0.1M Na-K+磷酸盐缓冲液(pH＝7.0)，与5μl的样品溶液在30℃预孵育30min后，加入25μl的4mM Z-Gly-Pro-AMC底物开始反应，60min后，加入500μl的醋酸盐缓冲液(pH＝4.2)停止反应。依据荧光法，在激发波长为380nm发射波长为460nm下，测定AMC的荧光吸光度。每份样品平行测定3次，取平均值计算抑制率I。计算公式如下 Inhibition(％)＝(A-B)/A×100％ A不含样品时，POP酶使底物水解产生AMC的荧光值 B含有样品时，POP酶使底物水解产生AMC的荧光值 (3)实验结果 北沙参总木酯素在100μg/ml的浓度，对脯氨酰寡肽酶的抑制率为82.9％，说明其具有很强的保护和调节肽能神经功能的作用。
实施例6 北沙参总木酯素对小鼠记忆再现障碍的改善作用 (1)实验方法 取体重18-20g雄性小鼠30只，均分三组，即空白组、模型组、给药组ig 500mg/Kg。空白组与模型组用等体积的10％吐温80灌胃。每天一次，连续7天，末次给药1h后开始训练。24h后进行重新测试(避暗法)，测试前30min除空白组灌胃等容积的10％吐温80外，其余各组均分别灌胃40％乙醇10ml/kg。记录由明室进入暗室的潜伏期和5分总内的错误次数。
(2)实验结果 连续给药7天北沙参总木酯素可使小鼠测试时的错误次数显著减少，潜伏期延长，表明其对乙醇引起的小鼠记忆再现缺失具有一定的改善作用。结果见表2。
*与模型组比较p＜0.05。
权利要求
1.北沙参总木酯素的制备方法，包括粉碎，经乙醇回流提取，大孔吸附树脂吸附，用水洗去杂质，用醇液洗脱，乙酸乙酯萃取除杂等步骤，其特征在于由以下方法制备
步骤1未经产地加工，保留根外皮的北沙参干燥药材，粉碎成粗粉，粗粉加6-7倍量的70-75％乙醇浸泡，加热回流提取，每次1.5-2小时，提取2-3次，合并各次提取液，减压浓缩至50℃时浓缩液相对密度为1.20-1.30；
步骤2步骤1所得浓缩液经D101型或Diaion HP-20型大孔吸附树脂吸附，用0-5％稀醇洗去杂质，再用70-85％醇液洗脱得醇溶液，回收溶剂得浸膏；
步骤3步骤2所得浸膏混悬于水中，加入等体积乙酸乙酯，萃取3-4次，减压回收溶剂，合并萃取物，得到北沙参总木酯素类成分。
2.根据权利要求1所述的北沙参总木酯素的制备方法，其特征在于所制备的北沙参总木酯素类成分经反复的Sephadex LH-20柱色谱及反相ODS柱色谱，水-甲醇混合溶剂梯度洗脱，得到8个木酯素或异木酯素类化合物，分别为可来灵素A、B、C、D、E、F，橙皮素A，以及(-)-secoisolariciresinol 4-O-β-D-glucopyranoside。
3.根据权利要求1所述的北沙参总木酯素的制备方法，其特征在于所制备的北沙参总木酯素可以与药学上可接受的载体混合，制成片剂、胶囊剂、颗粒剂。
4.根据权利要求1所述的北沙参总木酯素的制备方法，其特征在于所制备的北沙参总木酯素可以与其它药物混合制成复方制剂。
5.北沙参总木酯素在制备保护脑功能、增强学习记忆、治疗老年性痴呆药物及保健品中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种从中药北沙参中制备北沙参总木酯素的方法用途。该方法不仅有效地解决了北沙参木酯素类成分的提取纯化问题，而且工艺稳定、质量可控。主要是通过70-75％乙醇提取2～3次，大孔吸附树脂吸附，用水洗去杂质，用70-85％醇液洗脱，回收溶剂，所得浸膏，用乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯，得北沙参总木酯素，主要含有可来灵素A、B、C、D、E等活性成分。北沙参总木酯素具有抗氧化、对自由基诱导的鼠脑乙酰胆碱酯酶抑制的保护作用、以及脯氨酰寡肽酶抑制作用，能够显著提高模型动物学习记忆能力，可作为增强学习记忆和抗老年性痴呆药物或保健品的原料，与药学上可接受的载体混合，按常规工艺制成片剂、胶囊剂、颗粒剂或复方制剂。
文档编号A61P25/28GK101757061SQ20101010102
公开日2010年6月30日 申请日期2010年1月26日 优先权日2010年1月26日
发明者
原忠, 李铣, 许奕, 谷雪, 王欢 申请人:沈阳药科大学