壳聚糖?没食子酸共聚物的制备方法及用图
【专利摘要】本发明公开了一种壳聚糖?没食子酸共聚物的制备方法，通过自由基介导的方法合成了壳聚糖?没食子酸接枝共聚物，并通过紫外?可见光谱、傅立叶变换红外光谱和核磁共振氢谱对所制备的产物进行了表征，结果显示没食子酸被成功地接枝到壳聚糖上。接枝率不同的壳聚糖?没食子酸的抗菌性能不同，接枝率较高的壳聚糖?没食子酸具有比壳聚糖更为优良的抗菌性，此外，壳聚糖?没食子酸展现出优异的止血性能，能够有效减少出血量。结果表明，壳聚糖?没食子酸有可能在止血材料领域发挥一定的作用。
【专利说明】
壳聚糖-没食子酸共聚物的制备方法及用途
技术领域
[0001 ]本发明涉及一种具有止血功能的壳聚糖-没食子酸共聚物及其用途。
【背景技术】
[0002] 目前可使用的止血材料种类较多，纤维素有较好的可塑性和相对松散的结构，对 肌肉和软组织有明显的止血效果，但其吸附血液的能力较差，在止血过程中需要使用相对 较多的纤维素材料，造成所需费用增加，并且纤维素不易与创口粘附，使再出血的可能性增 加，不易控制大创面出血。临床使用的最广泛的止血材料是明胶海绵，该材料使用方便、价 格便宜，但是其所含有的胶原蛋白容易造成变态反应，使创口的炎症反应和感染率增加，同 时由于其粘附力较差，容易造成二次出血。临床上也使用纤维蛋白作为止血材料，由于其本 身是异种蛋白，所以容易诱发局部的炎症反应，因而限制了其使用。多聚糖也是一种常见的 止血材料，具有良好的生物相容性，并能被组织分解吸收，不引发炎症反应，但多聚糖在通 过膨胀止血的同时，会使体内在局部产生大量的剩余热，使所在组织损伤加重。因此需要发 展一些具有良好止血作用的生物止血材料。
[0003] 壳聚糖因其优秀的生物相容性、生物可降解性、抗感染性已被广泛用于伤口包扎 材料，但壳聚糖自身的止血效果有限，为提高其止血性能，可采用壳聚糖与其它具有特殊功 能的物质接枝后使用的方法，接枝后的壳聚糖可以发挥两种材料的优点。没食子酸是一种 天然多酚类化合物，具有良好的抗炎性和抗菌性。将没食子酸接枝到壳聚糖上，有可能赋予 壳聚糖一些特殊的性能，增强其止血效果。
【发明内容】
[0004] 本发明的一个目的是提供一种壳聚糖-没食子酸共聚物的制备方法，本发明的另 一个目的是提供在壳聚糖-没食子酸共聚物制备医用止血剂中的用途。
[0005] 本发明所提供的壳聚糖-没食子酸共聚物的制备方法是:在氮气保护下，以1~5% 的乙酸溶液为反应溶剂，以过氧化氢/抗坏血酸氧化还原对为自由基引发剂，壳聚糖与没食 子酸的质量比为1:2~5,将壳聚糖与没食子酸进行反应，通入空气以淬灭反应，蒸馏水透析 后进行冷冻干燥，即得。
[0006] 优选地，所述过氧化氢/抗坏血酸氧化还原对为:每lmL30 %过氧化氢溶液中含有 抗坏血酸100mg。
[0007] 进一步优选地，所述壳聚糖与没食子酸的质量比为1:3.2。
[0008] 以金黄色葡萄球菌为测试菌种，对壳聚糖-没食子酸共聚物进行了抗菌性研究，结 果表明壳聚糖-没食子酸共聚物相比于壳聚糖有更好的抑菌效果。使用不同的样品作用于 大鼠肝创面出血模型，结果显示，壳聚糖-没食子酸共聚物相较于壳聚糖，能够有效减少出 血量，且结果具有显著性差异。这种没食子酸接枝的壳聚糖衍生物增强了壳聚糖本身的抗 菌性和止血性，有望成为一种新型的止血材料。
【附图说明】
[0009] 图1是壳聚糖、没食子酸、壳聚糖-没食子酸共聚物的紫外-可见吸收光谱。
[0010] 图2是壳聚糖、没食子酸、壳聚糖-没食子酸共聚物的傅立叶变换红外光谱。
[0011] 图3是没食子酸、壳聚糖和壳聚糖-没食子酸共聚物的核磁共振氢谱。
[0012] 图4是没食子酸的标准曲线。
[0013] 图5是壳聚糖-没食子酸共聚物的抑菌试验结果。
[0014] 图6是空白对照和壳聚糖的抑菌试验结果。
[0015] 图7是SD大鼠的肝创面止血实验结果，图中a为壳聚糖组，b为壳聚糖-没食子酸共 聚物组。
【具体实施方式】
[0016] 以下通过实施例对本发明进行详细地说明。
[0017] 1.方法
[0018] 1.1仪器与材料
[0019]壳聚糖(浙江玉环海洋生物科技有限公司），没食子酸(分析纯，天津市大茂化学试 剂厂），过氧化氢(30wt%，天津市福晨化学试剂厂），抗坏血酸(分析纯，国药集团化学试剂 有限公司），甲醇(分析纯，国药集团化学试剂有限公司），水合氯醛(分析纯，武汉意德生物 技术有限公司），医用脱脂纱布（湖北中健医疗用品有限公司），医用脱脂棉(徐州卫材卫生 材料有限公司），大鼠（SD，SPF级，湖北省实验动物研究中心），电子天平(FA2014N，上海精密 科学有限公司），集热式恒温磁力搅拌器(DF-101S，郑州长城科工贸易有限公司），冷冻干燥 机（LGJ-1B，北京亚泰科隆仪器有限公司），红外光谱仪（Vator 360，Nicolet， Massachusetts，USA)，4核磁共振仪（400spectrometer，Varian，USA)，循环水式真空栗 (SHB-m，郑州长城科工贸易有限公司），磁力搅拌器(85-2,常州国产电器有限公司）。
[0020] 1.2壳聚糖-没食子酸共聚物的合成
[0021] 在氮气保护下，以过氧化氢/抗坏血酸氧化还原对为自由基引发剂，通过没食子酸 与壳聚糖之间的自由基反应来制备壳聚糖-没食子酸共聚物。
[0022] 方法1:取壳聚糖400mg置于100mL的schlenk瓶中，用盐水塞封住瓶口，用双排管抽 真空后通入氮气(重复3次）；向schlenk瓶中注入50mL乙酸溶液（1%，v/v)，搅拌至溶液澄清 后，取抗坏血酸l〇〇mg溶于lmL30%过氧化氢溶液中，并将其注入schlenk瓶中，在磁力搅拌 下反应半小时后，取没食子酸800mg，溶于适量乙醇，并将其注入schlenk瓶中。在30°C下搅 拌反应24h后，通入空气以淬灭反应，将反应液装入3500Da的透析袋中，用蒸馏水透析72h， 中途换水12次。将透析后的溶液进行冷冻干燥，得到壳聚糖-没食子酸产品，将其保存到 10mL的EP管中。
[0023] 方法2:取壳聚糖160mg置于100mL的schlenk瓶中，用盐水塞封住瓶口，用双排管抽 真空后通入氮气(重复3次）；向schlenk瓶中注入50mL乙酸溶液(5%，v/v)，搅拌至溶液澄清 后，取抗坏血酸l〇〇mg溶于lmL30%过氧化氢溶液中，并将其注入schlenk瓶中，在磁力搅拌 下反应半小时后，取没食子酸800mg，溶于适量乙醇，并将其注入schlenk瓶中。在20°C下搅 拌反应48h后，通入空气以淬灭反应，将反应液装入3500Da的透析袋中，用蒸馏水透析72h， 中途换水12次。将透析后的溶液进行冷冻干燥，得到壳聚糖-没食子酸产品，将其保存到 10mL的EP管中。
[0024] 方法3:取壳聚糖250mg置于100mL的schlenk瓶中，用盐水塞封住瓶口，用双排管抽 真空后通入氮气(重复3次）；向schlenk瓶中注入50mL乙酸溶液(2%，v/v)，搅拌至溶液澄清 后，取抗坏血酸l〇〇mg溶于lmL30%过氧化氢溶液中，并将其注入schlenk瓶中，在磁力搅拌 下反应半小时后，取没食子酸800mg，溶于适量乙醇，并将其注入schlenk瓶中。在25°C下搅 拌反应36h后，通入空气以淬灭反应，将反应液装入3500Da的透析袋中，用蒸馏水透析72h， 中途换水12次。将透析后的溶液进行冷冻干燥，得到壳聚糖-没食子酸产品，将其保存到 10mL的EP管中。
[0025] 1.3壳聚糖-没食子酸共聚物的表征
[0026]为了确认是否成功地将没食子酸接枝到壳聚糖上，分别用紫外-可见光谱、傅立叶 变换红外光谱和核磁共振氢谱对所制备的壳聚糖-没食子酸进行了表征。将壳聚糖和壳聚 糖-没食子酸样品溶于2%的乙酸溶液中，分别配制成一定浓度的溶液，以2%的乙酸溶液为 对照，在200-600nm的范围内进行扫描。将干燥的样品与溴化钾一起研磨成粉末，并压制成 薄片，以溴化钾为对照，在4000-400(^ 1的范围内进行傅立叶变换红外光谱的检测。将样品 溶于DC1/D20( 1 %，v/v)中进行核磁共振检测。
[0027] 1.4壳聚糖-没食子酸共聚物接枝率的测定
[0028] 用改进的福林酚法测定壳聚糖-没食子酸中没食子酸的接枝比例。精密称取没食 子酸50.0mg，置于 100mL容量瓶中，用蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成储备液。精密 量取 5〇1^、7〇1^、9〇1^、11〇1^、13〇1^、150乩、17〇1^、19〇1^和21〇1^的储备液，置于1〇11^容量 瓶中，加蒸馏水4mL，然后分别加入福林酚试剂lmL，混匀，在30°C下避光反应30min，然后分 别向各容量瓶中加入10%碳酸钠溶液至10mL。以没加入储备液的溶液为对照，分别在760nm 处测定其吸光度，每个样品平行测定三次。处理数据，并制作标准曲线。精密称取一定量的 壳聚糖-没食子酸，配制成适用于朗伯-比尔定律的浓度，取4mL配置好的壳聚糖-没食子酸 溶液置于10mL容量瓶中，然后加入福林酚试剂lmL，混匀，在30°C下避光反应30min，然后加 入10 %碳酸钠溶液至10mL，在760nm处测定其吸光度，并根据标准曲线计算出壳聚糖-没食 子酸中没食子酸的含量，结果表示成每克干燥的壳聚糖-没食子酸中没食子酸的毫克数(mg 没食子酸/g壳聚糖-没食子酸）。
[0029] 1.5壳聚糖-没食子酸共聚物的抗菌性研究
[0030] 将供试菌(金黄色葡萄球菌)种接到对应的斜面培养基上，将培养基置于37°C的恒 温培养箱中培养24h;分别挑选出一环已活化的菌种置于9mL无菌生理盐水中，打碎并使其 分散在生理盐水中，振荡摇匀，制成菌悬液。
[0031] 分别称取25mg壳聚糖和三种不同接枝比的壳聚糖-没食子酸，溶于5mL蒸馏水中， 加入3滴乙酸助溶，配制成0.5%的待测样品溶液，以加入了 3滴乙酸的5mL蒸馏水为对照组， 将所有配置好的溶液装入lOmLEP管中备用。分别称取5g氯化钠、5g蛋白胨、2.5g牛肉膏，配 制成500mL的水溶液，并用氢氧化钠溶液调节pH至7.2。量取200mL牛肉膏蛋白胨溶液，移至 250mL锥形瓶中，加入3g琼脂粉，用橡胶塞塞住瓶口，并用报纸封住瓶口附近区域，用橡皮筋 扎牢。同法包扎其它待灭菌的物品。将装有牛肉膏蛋白胨溶液的锥形瓶、装有待测样品溶液 的EP管、装有移液管的管架、镊子和培养皿放入高压蒸汽灭菌锅中，灭菌15min后，将灭菌后 的物品移至无菌操作台。
[0032] 接通无菌操作台的电源，用紫外灯照射15min后，打开风机通风5min。待双手进入 工作台后，用乙醇对双手进行消毒。将培养皿在操作台中央铺开，分别向每个培养皿中倒入 含有琼脂粉的牛肉膏蛋白胨溶液，以恰好自然覆盖培养皿底部为准。待含琼脂的牛肉膏蛋 白胨溶液固化后，吸取200uL预先培养好的菌悬液至固体培养基表面涂抹均匀，用灭菌过的 镊子分别夹取灭菌后的牛津杯放置在含菌培养皿中并做好标记，吸取200uL样品溶液至牛 津杯中。将固体培养皿置于37°C的恒温培养箱中培养24h后观察是否具有抑菌圈出现，若有 抑菌圈出现，抑菌圈的大小则代表相应物质的抗菌性强度。
[0033] 1.6壳聚糖-没食子酸共聚物的止血性研究
[0034] 取健康的成年SD大鼠九只，分成三组，每组三只，A组为壳聚糖组，B组为壳聚糖-没 食子酸组，C组为空白对照组。给每只SD大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液(30mg/100g)，麻醉 成功后，将SD大鼠平放在实验台上，沿腹中线作一长约3cm的纵形切口，逐层进入腹腔，暴露 肝右叶，用干净纱布吸干腹腔液后，将肝中叶置于一块已知重量的的纱布上，用刀片在肝右 叶作一处长2cm，深0.5cm的创面，用200mg的样品进行止血，并开始计时，每隔30s观察一次 止血效果，记录出血量，出血量用止血前后纱布的重量差表示。
[0035] 2.结果
[0036] 2.1壳聚糖-没食子酸共聚物的合成
[0037] 目前合成壳聚糖-没食子酸共聚物的方法较多，例如:传统的一类由合成多肽类化 合物而发展起来的通过EDC/NHS活化羧基的方法，这种方法操作简单但是所得产物的接枝 比太低；最近，发展起来一类用EDC活化羧基的同时用HOBt活化氨基方法，这种方法得到的 产物的接枝比较高，但是用到了较多的化合物进行催化，可能会造成残留；同时，也有一种 通过漆酶催化的方法，相对而言该方法对反应条件要求较高，在合成的过程中不易进行。
[0038] 在本研究中，采用抗坏血酸/过氧化氢氧化还原对的方法，在氮气的保护下将没食 子酸接枝到壳聚糖上，该方法所用的原料均为无毒害的物质，其中过氧化氢可以转化为无 毒害的水和氧气，整个反应体系满足绿色化学的要求。
[0039] 在乙酸溶液中，抗坏血酸以二元酸(AscH2)的形式存在，并且可以和过氧化氢反应 以生成羟基自由基(H0 ·)和共振稳定的三羰基抗坏血酸自由基(AscH ·)。三羰基抗坏血酸 自由基的PK为-0.86,所以其不能以质子化的状态存在，而是形成半脱氢抗坏血酸自由基 (Asc ·-)的形式存在。随后，形成的羟基自由基作为合成壳聚糖-没食子酸的引发剂，羟基 自由基夺去壳聚糖羟基和氨基上的电子，从而产生壳聚糖巨自由基，在壳聚糖巨自由基周 围的反应位点上的没食子酸成为自由基接受体，从而形成了壳聚糖-没食子酸。
[0040] 3.2壳聚糖-没食子酸共聚物的表征
[0041] 为了确认没食子酸成功地接枝到壳聚糖上，通过紫外-可见光谱、傅立叶变换红外 光谱和核磁共振氢谱对所制备的壳聚糖-没食子酸进行了分析。
[0042] 如图1所示，没食子酸分别在212nm和262nm处展示出苯环π体系的吸收带，壳聚糖 在扫描范围内没有任何吸收。然而，对于壳聚糖-没食子酸共聚物，在272nm处展现出一条新 的吸收带，且该吸收带的强度随着没食子酸的接枝比例的增加而增强，说明没食子酸成功 地接枝到壳聚糖上。
[0043]没食子酸、壳聚糖和壳聚糖-没食子酸共聚物的傅立叶变换红外光谱如图2所示。 没食子酸展示了酚类物质的特征吸收，即在3200-3550(3!!^处苯环羟基的伸缩振动和 1365CHT1处羟基的弯曲振动，ΗδΟ-ΙΘΟΟαιΓ1处苯环双键的伸缩振动和碳氧单键和碳碳单键 在1200-1300(^ 1处的伸缩振动。对于壳聚糖，在3200-3500(^1处展示出属于Ν-Η和0-Η的伸 缩振动。在ΙθδΟαιΓ^ΙδδΟαιΓ 1和1320CHT1处的吸收属于羰基的碳氧双键的伸缩振动、N-H氮 氢单键的弯曲振动和C-N碳氮单键的伸缩振动。1595CHT 1处的吸收带是一级氨Ν-Η的弯曲振 动。1420CHT1和1380CHT1处的吸收带分别属于亚甲基的弯曲振动和甲基的对称振动。在 1160CHT 1处C-0-C的不对称伸缩振动、1033CHT1和1075CHT1处C-0的伸缩振动为壳聚糖的特征 峰。相比于壳聚糖，壳聚糖-没食子酸样品中在1595CHT 1处属于一级氨Ν-Η伸缩振动的吸收峰 消失了，说明氨基与壳聚糖的反应使一级氨变成了二级氨。
[0044] 壳聚糖、没食子酸和壳聚糖-没食子酸共聚物的核磁共振氢谱如图3所示。壳聚糖 在2.9ppm处有一个单峰，在3.3-3.7ppm处有一组多重峰并且在4.4ppm处有一个较小的单 峰，它们分别属于11-2，!1-3、!1-4、!1-5和!1-6，!1-1。1.8??111处的单峰代表1乙酰葡萄糖胺单元 的三个质子。相比于壳聚糖，壳聚糖-没食子酸在6.9ppm处展示出属于没食子酸苯环质子的 新峰。
[0045] 3.3壳聚糖-没食子酸共聚物接枝率的确定
[0046] 不同浓度的没食子酸的吸光度数据如表1所示，以没食子酸的浓度为横坐标，以平 均吸光度为纵坐标作图，舍去误差较大的吸光度不在〇. 2-0.8之间的最后一组数据，得到没 食子酸的标准曲线，如图4所示。该直线的表达式为Abs = 56.564C+0.1467，R2 = 0.9971。
[0047] 将壳聚糖-没食子酸共聚物配制成能够用分光光度法检测出来的浓度，分别测定 三种方法制备的壳聚糖-没食子酸的吸光度，其结果如表2所示。根据标准曲线可得三种方 法制备的壳聚糖-没食子酸共聚物的接枝比分别为:6.69mg GA/g，8.44mg GA/g和83.6mg GA/g〇
[0048] 表1福林酚法测得的不同浓度没食子酸溶液的吸光度
[0049]
[0050] ~表2福林酚法测得的壳聚糖-没食子酸在760nm处的吸光度 ' '
[0051]
[0052] 3.4壳聚糖-没食子酸共聚物的抗菌性研究
[0053] 将培养皿置于37°C恒温培养箱中培养24h后，取出培养皿，结果如图5、6所示。从图 中我们可以看到除了空白对照组外，其它的四组均有不同大小的抑菌圈，但是抑菌圈外周 还有一个同心圆的圈，这是培养时间过长，细菌再次生长所导致的。用游标卡尺分别测量内 圈和外圈的直径，结果如表3所不。
[0054]表3壳聚糖、壳聚糖-没食子酸共聚物和空白对照的抑菌圈大小
[0055]
[0056]结果显示，壳聚糖及壳聚糖-没食子酸的抑菌圈均较空白对照组大，说明壳聚糖及 壳聚糖-没食子酸均有一定的抗菌作用;不同接枝比的壳聚糖-没食子酸的抑菌圈的大小不 同，壳聚糖-没食子酸的接枝比越高，其抑菌圈越大，说明接枝比高的壳聚糖-没食子酸抗菌 效果更好;不同的壳聚糖-没食子酸相比于壳聚糖，其抑菌圈呈现出不同的大小关系，接枝 比较小的壳聚糖-没食子酸相对于壳聚糖，其抑菌圈并没有显著的区别，而接枝比较高的壳 聚糖-没食子酸相对于壳聚糖，其抑菌圈明显增大，说明将较少的没食子酸接枝到壳聚糖上 对壳聚糖本身的抗菌性没有明显的改善，随着接枝到壳聚糖上的没食子酸的增多，抗菌性 逐渐增强。
[0057] 3.5壳聚糖-没食子酸共聚物的止血性能研究
[0058]大体观察:a组用壳聚糖粉末覆盖在伤口表面，撒上壳聚糖粉末后，渗出的血液凝 固地较快，形成了血液壳聚糖粉末的混合物，该混合物牢固地粘附在切口表面;b组用壳聚 糖-没食子酸粉末覆盖在伤口表面，撒上壳聚糖-没食子酸粉末后，渗出的血液快速地凝固， 从表面来看，外表面的壳聚糖-没食子酸没有血迹。止血具体状况见图7。
[0059] 表4各组SD大鼠肝创面出血量
[0060]
[0061]壳聚糖组和壳聚糖-没食子酸组平均出血量分别为：1.625g和1.17g，差异具有统 计学意义(P〈〇.05)，实验结果表明接枝后的壳聚糖-没食子酸比壳聚糖有更好的止血效果， 能有效地减少出血量。
[0062] 3.结论
[0063] 本发明以壳聚糖和没食子酸为原料，在氮气的保护下，以过氧化氢/抗坏血酸氧化 还原对为自由基引发剂，制备了接枝没食子酸的壳聚糖衍生物。紫外-可见光谱、傅立叶变 换红外光谱和核磁共振氢谱的结果表明，成功地合成了壳聚糖-没食子酸接枝共聚物。这种 没食子酸修饰的壳聚糖衍生物呈灰色粉末状，且具有良好的水溶性。以金黄色葡萄球菌为 测试菌种，对不同接枝比的壳聚糖-没食子酸进行了抗菌性研究，结果表明较高接枝比的壳 聚糖-没食子酸相比于壳聚糖有更好的抑菌效果。使用不同的样品作用于大鼠肝创面出血 模型，结果显示，壳聚糖-没食子酸相较于壳聚糖，能够有效减少出血量，且结果具有显著性 差异。综上所述，这种没食子酸接枝的壳聚糖衍生物增强了壳聚糖本身的抗菌性和止血性， 有望成为一种新型的止血材料。
【主权项】
1. 一种壳聚糖-没食子酸共聚物的制备方法，其特征在于:在氮气保护下，以1~5%的 乙酸溶液为反应溶剂，以过氧化氢/抗坏血酸氧化还原对为自由基引发剂，壳聚糖与没食子 酸的质量比为1:2~5,将壳聚糖与没食子酸进行反应，通入空气以淬灭反应，蒸馏水透析后 进行冷冻干燥，即得。2. 如权利要求1所述壳聚糖-没食子酸共聚物的制备方法，其特征在于所述过氧化氢/ 抗坏血酸氧化还原对为:每lmL30%过氧化氢溶液中含有抗坏血酸lOOmg。3. 如权利要求1所述壳聚糖-没食子酸共聚物的制备方法，其特征在于:所述壳聚糖与 没食子酸的质量比为1:3.2。4. 壳聚糖-没食子酸共聚物在制备医用止血剂中的用途，所述壳聚糖-没食子酸共聚物 是采用权利要求1~3任何一项所述的方法制备的。5. -种医用止血剂，其活性成分是壳聚糖-没食子酸共聚物，所述壳聚糖-没食子酸共 聚物是采用权利要求1~3任何一项所述的方法制备的。
【文档编号】A61P7/04GK106084088SQ201610398571
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月6日
【发明人】刘诗久, 张政, 张雪琼
【申请人】武汉艾美博特医疗用品有限公司