专利名称：表没食子儿茶素没食子酸酯的新用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)的新用途。
背景技术：
MTS增殖实验是MTT实验的改良版，CellTiter 96 AQueous非放射性细胞增殖检测以比色法确定在细胞增殖实验中的活细胞数目。这个系统由一种新型甲臢化合物MTS和一个电子偶联剂PMS组成。新陈代谢活跃的活细胞内的脱氢酶类将MTS转化成液态可溶的甲臢化合物，由490nm测量的吸收值所表示的甲臢产物的数量与培养物中活性细胞的数量成正比。
在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸(PS)只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸(PS)由脂膜内侧翻向外侧。Armexin V与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。将Armexin V进行荧光素(FITC)标记，利用荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。
EGCG是从绿茶中提取分离的一种多酚类单体化合物，是绿茶中儿茶素类化合物的主要组成部分。然而EGCG不能人工合成，茶叶是唯一的来源。近年来的研究发现，其具有抗肿瘤、抗氧化、降血脂、抗炎症、防辐射等多种重要的生物活性。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种表没食子儿茶素没食子酸酯在制备诱导胶质瘤细胞的凋亡药物中的应用。本发明的目的之二在于提供表没食子儿茶素没食子酸酯在制备抑制胶质瘤细胞的增殖药物中的应用。本发明采用的表没食子儿茶素没食子酸酯是从植物中提取出来，提取方法，请参见以下文献
1Ryszard Amarowicz, Fereidoon Shahid. A rapid chromatographic method for separation of individual catechins from green tea [J] . Food Research International,1996, 29:71—76。
2Kang Guanwen,Qian Benzhi,Ren Ruili,et al. Extraction of natural efective antioxidants from tea and study of oxidation resistance [J]. Taiyuan Gongye Daxue Xuebao，1989，20 (3) :49—52。
图1为U251细胞被EGCG处理48小时结果图； 图2为U251细胞被EGCG处理72小时结果图； 图3为EGCG处理U251细胞48小时，细胞凋亡实验结果图。
具体实施例方式1胶质瘤U251细胞的培养胶质瘤U251细胞系于37°C，5%C02恒温培养箱。对数生长期的细胞用胰酶消化脱壁，再加入适量培养液以易于混勻细胞；用移液器将其移入15ml 离心管中，1500rpm离心^iin ；去上清；用5ml无菌IXPBS将细胞悬起，并吹打混勻；加约 2ml细胞悬液于装有5ml新鲜培养基的新培养瓶中，放入37°C，5%C02培养箱中培养，约3天左右传代1次。2 MTS细胞增殖实验对数生长期的细胞用胰酶消化脱壁，再加入适量培养基用于混勻细胞，然后细胞转入96孔板中，细胞计数板计数每孔IX IO5个/ml，然后培养于培养箱。细胞密度在70-80%，设对照组和四个实验组，每组六个重复，加入EGCG的浓度为， 25，50,75，100ug/ml，然后培养48和72小时后进行检测。取出CellTiter 96 AQueous One Solution Reagent，37°C水浴10分钟融化；将细胞从培养箱中取出，在96孔板中，每孔 100μ1 培养基加 5· 2μ1 CellTiter 96 AQueous One Solution Reagent ；在 37°C，5%C02 的环境下孵育1小时；酶标仪490nm读取吸光度值。实验重复三次。3细胞凋亡实验把对数期生长的细胞用胰酶消化脱壁，然后加入新的培养基用于混勻细胞，细胞计数后于M孔板培养，细胞密度达到70-80%，然后加入EGCG，浓度分别为，50，80，100ug/ml，然后与培养箱培养48小时之后进行实验。离心收集细胞2000 r. p. m， 5分钟；用冷的PBS洗涤细胞2次，然后再次离心收集细胞2000 rpm, 5分钟；加入400 μ 1 Binding Buffer重悬细胞；加入5 μ 1 Annexin V-FITC，温和颠倒混勻，于室温孵育15分钟，避光(用锡箔纸包裹);将细胞悬液涂片，盖上盖玻片；用荧光显微镜检测。绿色荧光细胞即为凋亡细胞与长光下细胞的比值就是凋亡率。结果细胞增殖实验结果(图1，2，3)，加EGCG实验组，OD值明显小于对照组，表明 EGCG可以明显抑制胶质瘤细胞的增殖(Ρ<0. 001)，随着EGCG加药量以及时间的延长的增加，细胞抑制更明显；细胞凋亡实验结果，加EGCG48小时后，随着浓度的增加，细胞凋亡的数目明显增加。
权利要求
1.一种表没食子儿茶素没食子酸酯在制备诱导胶质瘤细胞的凋亡药物中的应用。
2.一种没食子儿茶素没食子酸酯在制备抑制胶质瘤细胞的增殖药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)在制备诱导胶质瘤细胞的凋亡药物中的应用以及制备抑制胶质瘤细胞的增殖药物中的应用。实验结果表明EGCG可以明显抑制胶质瘤细胞的增殖(P<0.001)，随着EGCG加药量以及时间的延长的增加，细胞抑制更明显；细胞凋亡实验结果，加EGCG48小时后，随着浓度的增加，细胞凋亡的数目明显增加。
文档编号A61K31/353GK102232947SQ201110044309
公开日2011年11月9日 申请日期2011年2月24日 优先权日2011年2月24日
发明者宋一超, 李红, 陈付学 申请人:上海大学