SO，振摇均匀后，放入酶标仪中，570 nm下读数。计算公式:月中瘤细胞生长抑制率％ =(OD对照-OD样品)/OD对照X100 %，实验模型设置:实验组:将试验药物用DMSO溶解，然后用培养基稀释使DMSO最终浓度为0.5%。每个单体化合物设三个剂量组，每个计量样品做3个孔的平行实验。空白实验组:只含有培养基，每块96孔板中留有3个孔的平行实验。阳性对照组:含有100 Pg.mL1浓度阳性药物5-氟尿嘧啶(5-FU)的培养基，每块96孔板中有3个孔的平行实验。阴性对照组:含有0.5%DMSO的培养基，每个样品做3个孔的平行实验。结果显示:阴性对照对U2-OS骨肉瘤细胞没有任何抑制作用，阳性对照100 Pg.mL 1浓度的5-氟尿嘧啶对U2-OS骨肉瘤细胞的抑制率为35.1%，没食子酸乙酯在100 Mg.mL 1时对U2-OS骨肉瘤细胞的抑制率为22.5%，在20 Mg.mL 1时对U2-OS骨肉瘤细胞的抑制率为18.4%，在4.mL 1时对U2-OS骨肉瘤细胞的抑制率为
10.3%。
[0025]实施例2:经传代后的细胞，倒掉培养基，用加样器吸取2 mL PBS打入培养瓶内，盖上盖子后，晃动几次后，倒掉PBS，重复此操作一次。用移液枪吸取1 mL胰酶，注入培养瓶内，旋紧盖子，平放培养瓶使胰酶均能浸润培养面。于倒置显微镜下观察，细胞变成单个圆形，则需要终止胰酶的消化。酒精棉擦拭后放入超净工作台，移液管吸取1 mL新鲜培养基打入培养瓶中，用移液枪吸取培养瓶内液体吹打培养瓶的细胞培养面，液体变成浑浊状态。将上述消化好的细胞，用新鲜培养基稀释，并吹打分散，吸取细胞悬液少许，滴加在盖玻片边缘，使悬液充满盖玻片和计数板之间。静置几分钟后，于倒置显微镜下观察，计数细胞板中四个大格细胞总数。调整细胞浓度为5000个/100 yLo用移液枪吸取200 的细胞悬液于96孔板的孔中，其中96孔板的四周不加，只加中间的6行10列，共60个孔。96孔板的四周加入PBS缓冲液，防止边缘效应。盖上盖子，并记录日期和时间，酒精喷板后，放入培养箱中培养。培养12 h后于倒置显微镜下观察，细胞贴壁后，酒精喷板，放入超净工作台中，用200 移液枪将孔内的培养基吸出，加入100 Mg.mL \20 Mg.mL \4 μ貧.mL 1的含药物的培养基培养，每孔200 Ml.盖上盖子，于倒置显微镜下观察，酒精喷板，放入培养箱中。培养48h后于超净工作台中每孔加入10 Ml ΜΤΤ，盖上盖子，酒精喷板后放入培养箱中培养。4 h后用移液枪吸出孔内液体，每孔加入150 Ml DMS0，振摇均匀后，放入酶标仪中，570 nm下读数。计算公式:肿瘤细胞生长抑制率％ = (0D对照-0D样品)/0D对照X100 %，实验模型设置:实验组:将试验药物用DMS0溶解，然后用培养基稀释使DMS0最终浓度为0.5%。每个单体化合物设三个剂量组，每个计量样品做3个孔的平行实验。空白实验组:只含有培养基，每块96孔板中留有3个孔的平行实验。阳性对照组:含有100 Pg
■ mL 1浓度阳性药物5-氟尿嘧啶(5-FU)的培养基，每块96孔板中有3个孔的平行实验。阴性对照组:含有0.5%DMS0的培养基，每个样品做3个孔的平行实验。结果显示:阴性对照对U2-0S骨肉瘤细胞没有任何抑制作用，阳性对照100 Mg.mL1浓度的5-氟尿嘧啶对U2-0S骨肉瘤细胞的抑制率为66.6%，没食子酸乙酯在100 Pg.mL 1时对U2-0S骨肉瘤细胞的抑制率为53.8%，在20# g.mL1时对U2-0S骨肉瘤细胞的抑制率为24.9%，在4.mL 1时对U2-0S骨肉瘤细胞的抑制率为13.7%。
[0026]实施例3:经传代后的细胞，倒掉培养基，用加样器吸取2 mL PBS打入培养瓶内，盖上盖子后，晃动几次后，倒掉PBS，重复此操作一次。用移液枪吸取1 mL胰酶，注入培养瓶内，旋紧盖子，平放培养瓶使胰酶均能浸润培养面。于倒置显微镜下观察，细胞变成单个圆形，则需要终止胰酶的消化。酒精棉擦拭后放入超净工作台，移液管吸取1 mL新鲜培养基打入培养瓶中，用移液枪吸取培养瓶内液体吹打培养瓶的细胞培养面，液体变成浑浊状态。将上述消化好的细胞，用新鲜培养基稀释，并吹打分散，吸取细胞悬液少许，滴加在盖玻片边缘，使悬液充满盖玻片和计数板之间。静置几分钟后，于倒置显微镜下观察，计数细胞板中四个大格细胞总数。调整细胞浓度为5000个/100 yLo用移液枪吸取200 的细胞悬液于96孔板的孔中，其中96孔板的四周不加，只加中间的6行10列，共60个孔。96孔板的四周加入PBS缓冲液，防止边缘效应。盖上盖子，并记录日期和时间，酒精喷板后，放入培养箱中培养。培养12 h后于倒置显微镜下观察，细胞贴壁后，酒精喷板，放入超净工作台中，用200 移液枪将孔内的培养基吸出，加入100 ug.mL \20 ug.mL \4 μ貧.mL 1的含药物的培养基培养，每孔200 ^Lo盖上盖子，于倒置显微镜下观察，酒精喷板，放入培养箱中。培养60h后于超净工作台中每孔加入10 uh MTT，盖上盖子，酒精喷板后放入培养箱中培养。4 h后用移液枪吸出孔内液体，每孔加入150 uh DMS0，振摇均匀后，放入酶标仪中，570 nm下读数。计算公式:肿瘤细胞生长抑制率％ = (0D对照-0D样品)/0D对照X100 %，实验模型设置:实验组:将试验药物用DMS0溶解，然后用培养基稀释使DMS0最终浓度为0.5%。每个单体化合物设三个剂量组，每个计量样品做3个孔的平行实验。空白实验组:只含有培养基，每块96孔板中留有3个孔的平行实验。阳性对照组:含有100 ug? mL 1浓度阳性药物5-氟尿嘧啶(5-FU)的培养基，每块96孔板中有3个孔的平行实验。阴性对照组:含有0.5%DMS0的培养基，每个样品做3个孔的平行实验。结果显示:阴性对照对U2-0S骨肉瘤细胞没有任何抑制作用，阳性对照100 iig.mL1浓度的5-氟尿嘧啶对U2-0S骨肉瘤细胞的抑制率为68.0%，没食子酸乙酯在100 ug.mL 1时对U2-0S骨肉瘤细胞的抑制率为73.8%，在20# g.mL1时对U2-0S骨肉瘤细胞的抑制率为30.6%，在4.mL 1时对U2-0S骨肉瘤细胞的抑制率为23.5%。
[0027]实施例4:经传代后的细胞，倒掉培养基，用加样器吸取2 mL PBS打入培养瓶内，盖上盖子后，晃动几次后，倒掉PBS，重复此操作一次。用移液枪吸取1 mL胰酶，注入培养瓶内，旋紧盖子，平放培养瓶使胰酶均能浸润培养面。于倒置显微镜下观察，细胞变成单个圆形，则需要终止胰酶的消化。酒精棉擦拭后放入超净工作台，移液管吸取1 mL新鲜培养基打入培养瓶中，用移液枪吸取培养瓶内液体吹打培养瓶的细胞培养面，液体变成浑浊状态。将上述消化好的细胞，用新鲜培养基稀释，并吹打分散，吸取细胞悬液少许，滴加在盖玻片边缘，使悬液充满盖玻片和计数板之间。静置几分钟后，于倒置显微镜下观察，计数细胞板中四个大格细胞总数。调整细胞浓度为5000个/100 yLo用移液枪吸取200 的细胞悬液于96孔板的孔中，其中96孔板的四周不加，只加中间的6行10列，共60个孔。96孔板的四周加入PBS缓冲液，防止边缘效应。盖上盖子，并记录日期和时间，酒精喷板后，放入培养箱中培养。培养12 h后于倒置显微镜下观察，细胞贴壁后，酒精喷板，放入超净工作台中，用200 移液枪将孔内的培养基吸出，加入100 ug.mL \20 ug.mL \4 μ貧.mL 1的含药物的培养基培养，每孔200 ^Lo盖上盖子，于倒置显微镜下观察，酒精喷板，放入培养箱中。培养72 h后于超净工作台中每孔加入10 uh MTT，盖上盖子，酒精喷板后放入培养箱中培养。4 h后用移液枪吸出孔内液体，每孔加入150 uh DMS0，振摇均匀后，放入酶标仪中，570 nm下读数。计算公式:肿瘤细胞生长抑制率％ = (0D对照-0D样品)/0D对照X 100 %，实验模型设置:实验组:将试验药物用DMSO溶解，然后用培养基稀释使DMSO最终浓度为0.5%。每个单体化合物设三个剂量组，每个计量样品做3个孔的平行实验。空白实验组:只含有培养基，每块96孔板中留有3个孔的平行实验。阳性对照组:含有100Ug.mL 1浓度阳性药物5-氟尿嘧啶(5-FU)的培养基，每块96孔板中有3个孔的平行实验。阴性对照组:含有0.5%DMS0的培养基，每个样品做3个孔的平行实验。结果显示:阴性对照对U2-OS骨肉瘤细胞没有任何抑制作用，阳性对照100 iig.mL1浓度的5-氟尿嘧啶对U2-OS骨肉瘤细胞的抑制率为70.0%，没食子酸乙酯在100 iig.mL1时对U2-OS骨肉瘤细胞的抑制率为83.8%，在20夕g.mL 1时对U2-OS骨肉瘤细胞的抑制率为40.6%，在4夕g.mL 1时对U2-OS骨肉瘤细胞的抑制率为33.5%。
[0028]首次将没食子酸乙酯应用到治疗骨肉瘤方面，没食子酸乙酯在高、中、低剂量下对骨肉瘤均有不同程度的抑制作用，且随着时间的推移，高浓度时治疗效果优于现在市场上的药物5-氟尿嘧啶(二者相同浓度)，具备成为替换5-氟尿嘧啶治疗骨肉瘤的可能。
【主权项】
1.没食子酸乙酯在治疗骨肉瘤方面的新用途，其特征在于:骨肉瘤为人U2-0S型。2.根据权利要求1所述的没食子酸乙酯，其特性在于:没食子酸乙酯单体化合物及其一切制剂类型。3.根据权利要求2所述的一切制剂类型，其特征在于:以没食子酸乙酯为原料，以国家批准的可用作制剂的材料为辅料，以不同配比制成的液体剂型、固体剂型、半固体剂型、气体剂型。
【专利摘要】尽管没食子酸乙酯的作用陆续被研究学者发现，但其在治疗骨肉瘤，特别是U2-OS型骨肉瘤方面的研究仍未见报道。本发明公开了一种没食子酸乙酯的新用途，尤其是在治疗U2-OS型骨肉瘤作用的用途没食子酸乙酯在应用到治疗骨肉瘤方面，没食子酸乙酯在高、中、低剂量下对骨肉瘤均有不同程度的抑制作用，且随着时间的推移，高浓度时治疗效果优于现在市场上的药物5-氟尿嘧啶（二者相同浓度），具备成为替换5-氟尿嘧啶治疗骨肉瘤的可能。
【IPC分类】A61K31/235, A61P35/00
【公开号】CN105412059
【申请号】CN201510865738
【发明人】马丽, 滕杰晖, 李维林, 任冰如, 陈剑, 吕寒
【申请人】江苏省中国科学院植物研究所
【公开日】2016年3月23日
【申请日】2015年12月2日