Norsampsone B在制备治疗或预防登革病毒感染药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及化合物NorsampsoneB的新用途，尤其设及NorsampsoneB在制备治 疗或预防登革病毒感染药物中的应用。
【背景技术】 阳00引登革病毒（Denguevirus,DENV)能够引起登革热，其通过伊蚊传播，严重感染者 出现登革出血热和登革休克综合症，病死率极高。该病毒有四个血清型，血清2型是流行病 株。本病主要在东南亚，太平洋地区和美洲的热带和亚热带国家中流行。中国广东省，海南 省，广西省曾经有14次不同规模的登革热流行。中国登革热的主要传播媒介是埃及伊蚊和 白蚊伊蚊。前者分布于南方沿海地区，后者则在南北地区广泛存在南北地区。有报道显示 已经从蚊子体内分离到登革病毒。但是，目前在临床上还没有有效的治疗药物。
[0003] 因此，我们应该高度重视对登革病毒的研究，加强对其的科研力度，做好相关知识 和药物的储备，为我国在防控登革病毒感染的方面做出一定的贡献。
[0004] 本发明设及的化合物NorsampsoneB是一个2014年发表（Wen-Jing Tian,eta1. ,NorsampsonesA~D,FourNewDecarbonylPolycyclic PolyprenylatedAcylphloroglucinolsfromHypericumsampsonii.Organic Letters, 2014, 16, 3448-3451.)的新化合物，该化合物拥有全新的骨架类型 (Wen-JingTian,etal.,NorsampsonesA-D,FourNewDecarbonylPolycyclic PolyprenylatedAcylphloroglucinolsfromHypericumsampsonii.OrganicLetters， 2014, 16, 3448-3451.)，对于本发明设及的NorsampsoneB在制备治疗或预防登革病毒感染 药物中的用途属于首次公开，由于属于全新的结构类型，而且其对于治疗或预防登革病毒 感染的活性强得意想不到，不存在由其他化合物给出任何启示的可能，具备突出的实质性 特点，同时用于治疗或预防登革病毒感染显然具有显著的进步。
【发明内容】
阳0化]本发明的目的是在于提供了一种NorsampsoneB在作为制备治疗或预防登革病毒 感染药物中的应用，NorsampsoneB能够有效地抑制登革病毒的增殖，但是对细胞毒性很 小，可进一步开发为治疗登革病毒感染疾病的药物，具有广泛的应用前景。
[0006] 所述化合物NorsampsoneB,结构如式（I)所示：
[0007]
[0008] 所述NorsampsoneB在制备治疗或预防登革病毒感染药物中的应用，Norsampsone B对DENV有抑制作用。
[0009] 一种治疗或预防登革病毒感染药物，由NorsampsoneB为活性成分添加辅料制备 而成，制备方法为取5克化合物NorsampsoneB,加入糊精195克，混匀，常规压片制成1000 片。
[0010] 一种治疗或预防登革病毒感染药物，由NorsampsoneB为活性成分添加辅料制备 而成，制备方法为取5克化合物NorsampsoneB，加入淀粉195克，混匀，装胶囊制成1000 粒。
[0011] 本发明设及的NorsampsoneB在制备治疗或预防登革病毒感染药物中的用途属于 首次公开，由于骨架类型属于全新的骨架类型，而且其对于登革病毒抑制活性强得意想不 至IJ，不存在由其他化合物给出任何启示的可能，具备突出的实质性特点，同时用于登革病毒 感染的防治显然具有显著的进步。
[0012] 为了实现上述目的，本发明采用W下技术方案：
[0013] 1、NorsampsoneB对Vero细胞的毒性实验：
[0014] Vero细胞是DENV的易感细胞。因此，本实验首先检测NorsampsoneB对Vero细胞 的细胞毒性，W不同浓度的NorsampsoneB作用于Vero细胞，来了解在细胞存活率为90% W上的NorsampsoneB的最大使用浓度，为后续的NorsampsoneB对DENV的抑制作用实验 提供参考数据。 阳〇1引 2、NorsampsoneB对DENV的抑制实验：
[0016] W不同浓度的NorsampsoneB作用于已经感染了DENV的Vero细胞，来获得 NorsampsoneB对病毒的抑制效率。本实验中的NorsampsoneB的使用浓度均在使Vero细 胞在90%W上存活率的浓度的范围内，因此，可W排除NorsampsoneB的浓度过高而对实 验数据的分析产生影响。
[0017] NorsampsoneB在治疗或预防登革病毒感染药物中的（抑制）应用，其基本过程 是：
[0018] A.NorsampsoneB对Vero细胞的毒性实验：
[0019] Vero细胞（非洲绿猴肾细胞）是DENV的易感细胞。实验中的Vero细胞购 买于中国科学院上海生科院细胞资料中屯、；MTT试剂盒购于碧云天生物技术研究所；胎 牛血清（FetalBovineSerum,FB巧购买于美国GIBC0公司；细胞培养板购买于德国 Greinerbioone公司；DMEM培养基和MEM培养基购买于美国GIBC0公司。
[0020] 实验步骤如下：
[0021] 1 :接种Vero细胞：用含10% (v/v)胎牛血清的DMEM培养基配成单个细胞悬液， W每孔1000-10000个细胞接种到96孔细胞培养板，每孔接种体积lOOul;
[0022] 2 :培养Vero细胞：在37°C，5% (v/v)C02培养条件下，培养2天；
[002引 3:加入NorsampsoneB:吸弃每个孔中的DMEM培养基，向各个孔中加入lOOul用 含10% (v/v)胎牛血清的DMEM培养基稀释成相应浓度（0uM，0. 4uM，1. 2uM，3. 7uM，lluM， 33uM，100uM，300uM)的NorsampsoneB，对照孔加不加含10% (v/v)胎牛血清的DMEM培养 基lOOul;
[0024] 4 :呈色：培养48小时后，每孔加MTT溶液lOul，在37°C，5% (v/v)C02培养条件下 继续解育4小时，然后加入化rmazan溶解液，在37°C，5% (v/v)C02培养条件下继续解育4 小时，直至在普通光学显微镜下观察发现化rmazan全部溶解； 阳〇2引 （1):测量：在570nm测定吸收值。
[0026] 表1不同浓度的NorsampsoneB对Vero细胞的毒性实验
[0027]
[0028]B.NorsampsoneB对DENV的抑制实验：
[0029] WVero细胞为培养病毒DENV的细胞，M0I为0. 1，实验步骤如下：
[0030] 在24孔细胞培养板中接入Vero细胞，24小时后细胞长至单层（细胞覆盖孔底 的面积约为80%~90% )，吸出培养基，接入病毒样品200ul，37°C吸附2小时。吸附完成 后，吸弃各孔中的病毒液，用DMEM培养基洗去未吸附的病毒。加入用含10% (v/v)胎牛血 清的DMEM培养基稀释的指定浓度（0uM，0. 04uM，0. 12uM，0. 37uM，1.luM，3. 3uM，10.OuM)的 NorsampsoneB，于37°C、5% (v/v)C02的培养箱中培养42小时，收集各个孔中的上清，做病 毒隧斑实验。
[0031] 病毒隧斑实验：在24孔板中接入Vero细胞，24小时后细胞长至单层（细胞覆盖 孔底的面积约为80%~90%)，吸弃各孔中的培养基，接入用含3% (v/v)胎牛血清的DMEM 培养基10倍系列稀释的病毒样品200ul，37°C吸附2小时。吸附完成后将各个孔的上清板 吸弃，用10% (v/v)FBS的DMEM培养基洗去未吸附的病毒。加入新鲜的45°C预热的半固 定培养基[A成分：3% (v/v)FBS，2XMEM培养基，青霉素（美国AMRESC0)和链霉素（美国 AMRESC0)终浓度分别为 100U/ml，0.Img/ml;B成分：1% (w/v)的琼脂糖（法国Bio