一种高效介导Lnc-MEG3基因过表达的慢病毒载体的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术和基因治疗领域，具体为一种高效介导lnc-MEG3基因过表 达的慢病毒载体系统的建立。
【背景技术】
[0002] IncRNA (long non-coding RNA, IncRNA)是一类转录本长度大于 200bp 的非编码 RNA，可作为人类基因组中一类重要的调控分子通过多种方式发挥其生物学功能。近年来的 研究表明，IncRNA也可以作为一种竞争性内源性RNA (competing endogenous RNA, ceRNA) 与lOmiRNA相互作用，参与靶基因的表达调控，并在肿瘤的发生发展中发挥重要的作用。
[0003] IncRNAs作为一种新型肿瘤标志物，它在肿瘤发生、发展的调控过程中起着非常 重要的作用，这种机制能为人们治疗肿瘤提供新的思路。目前人们对绝大多数IncRNAs 的生物和分子特性所知甚少，但是随着生物信息学发展，二级结构以及三级结构分析会为 IncRNAs的研究提供重要的手段，特别是其与编码序列之间的相互作用关系，这一方向的发 展将会拓展出全新的研究领域。大量由临床观察和实验研究所得的结果表明，IncRNAs的 异常表达会导致很多疾病的发生，这种机制在癌生物学中尤为重要。尽管涉及肿瘤的大多 数IncRNAs的作用机制还没得到准确阐明，但就其对部分已知IncRNA的研究发现，其参与 染色质重构和组蛋白修饰的调控，特别是通过表观遗传的修饰调控（例如基因印迹和组蛋 白修饰）会影响肿瘤的发生和迁移。例如，HOTAIR能通过调控染色质位点重排促进肿瘤转 移，而line P21通过p53途径将RNA〃DNA结合蛋白hnRNPK结合到染色质上实现其抑制剂 作用。
[0004] 母系表达基因3(MEG3)是首次由Miyoshi等在2000年发现的小鼠母系表达基因， 它是基因捕获基因座2(gene traplocus2，Gtl2)的人类同系物，定位于染色体14q32. 3,长 度约为1. 6kb。MEG3能编码出一条在许多正常组织中表达的IncRN A，但是它在初级肿瘤患 者和肿瘤细胞系中是缺失的（包括基因缺失，启动子商度甲基化和基因间位点的甲基化等 多重机制是造成MEG3基因缺失表达的主要因素）。研究发现，ME G3的重新表达能促进细 胞凋亡，从而抑制肿瘤细胞增殖。M EG3还能造成p53的积累，刺激p53介导的转录激活并 且选择性地调控P53靶基因表达。例如在小鼠中MEG3的去除能导致小鼠骨骼肌缺陷和围 产期死亡，而MEG3的失活能导致大脑中促血管生成基因表达增加和微脉管形成，这些证据 都表明MEG3能作为一个IncRNA肿瘤抑制剂。
[0005] 目前对LncRNA的研究正如日中天，而LNC-MEG3为印记基因，其在正常组织中高表 达，而在肿瘤组织中低表达，目前已证明其具有抑癌基因的功能，那么，如何提高其在肿瘤 细胞中的表达效率进而对其抑癌基因的功能基因鉴定，需要高效、稳定的过表达基因研究 的工具?
[0006] 有效的基因治疗依赖于外源基因商效、稳定的表达。肿瘤抗原基因导入细胞的方 法一般有两大类：一是以腺病毒、逆转录病毒、痘病毒和腺病毒相关病毒等为载体的病毒载 体方法；二是DNA脂质体复合物、磷酸钙沉淀、电穿孔等非病毒载体方法。非病毒载体方 法转染的优势在于：插入片段大小不受限制；免疫原性低；生产简便。其缺点是外源基因 的转染效率一般很低。病毒载体介导方法，以其高转染率和良好的靶向性成为肿瘤基因治 疗中应用最广泛的方法。利用病毒载体将带有肿瘤或病毒抗原的编码基因转染树突状细 胞制备的疫苗，由于可以在细胞内加工和持续表达相应特异性抗原，诱导产生特异性抗肿 瘤或抗病毒免疫应答而备受关注。其中最常用的包括逆转录病毒（retrovirus)、腺病毒 (adenovirus)和腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV)等载体。
[0007] 慢病毒（Lentivirus)载体是以HIV-1 (人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来 的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能 力。
[0008] 常用的病毒载体有腺病毒、逆转录病毒和慢病毒。逆转录病毒载体只能感染分裂 期细胞，而且容量有限，腺病毒一般不能整合到染色体上，只能进行瞬时感染。与其它逆转 录病毒相比，慢病毒（LV)具有可以感染非分裂期细胞、容纳外源性基因片段大，可以长期 表达等显著优点。慢病毒不产生任何有效的细胞免疫应答，可作为一种体外基因运输的工 具。慢病毒载体介导的转基因表达能持续数月，且无可观察到的病理学现象。
[0009] 慢病毒包装系统一般由慢病毒表达载体和慢病毒包装载体组成。
[0010] 而慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA到重组的假病毒载体所需要的 所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞， 在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清 液后，可以直接用于宿主细胞的感染。
[0011] 现有技术中，使用逆转录病毒、腺病毒携带lnc-MEG3基因进行细胞转染的效果并 不理想，存在表达量病毒滴度不够，重组表达量偏低等缺陷。而慢病毒载体中，也并非所有 种类均使用于携带lnc_MEG3基因。
[0012] 基于这样的需求，本发明开发了稳定高效表达LNC-MEG3目的基因的慢病毒表达 载体。
【发明内容】
[0013] 本发明的目的是为了构建一种能够高效介导lnc-MEG3过表达基因转移的慢病 毒，为基于lnc_MEG3的靶向治疗提供一种新的策略。
[0014] 本发明以慢病毒载体系统pCDH-EFl-MCS-T2A-copGFP，及包装质粒 pcDNA3. 0-LNC-MEG3为基础，将目的基因LNC-MEG3与质粒pCDH-T2A-GFP重组最终制备的 慢病毒将含有LNC-MEG3基因，具有LNC-MEG3基因的靶向性。选择GFP作为报告基因观察 改造后的慢病毒载体pCDH-EFl-MCS-T2A-copGFP-Lnc-MEG3对293细胞、骨髓原代CD34+ 细胞、KCL22细胞、XG7细胞、SK0-007细胞等不同肿瘤细胞的感染效率，分别检测感染后的 Lnc-MEG3过表达的效率，同时还观察了过表达Lnc-MEG3基因后的慢病毒对肿瘤细胞生物 学特性的影响。
[0015] 载体构建
[0016] 本申请中选用的慢病毒表达载体为pCDH-EFl-MCS-T2A-copGFP (7. 26Kb)和（可商 购于WWW.systembio. com, Cat. #Q)521A_1)，该载体是基于HIV的慢病毒载体，可以适用于 多种类型的分裂和非分裂宿主细胞，由EFla启动子驱动目的基因和与抗性基因转录为双 顺反子；二者之间含一段T2A肽，能够在翻译后水平上自我剪切，保证目的基因与抗性基因 翻译水平相同。将GFP基因整合入该慢病毒载体，形成pCDH-EFl-MCS-T2A-copGFP，使载体