亚硝酸盐含量降低的植物的产生的制作方法
【专利说明】亚硝酸盐含量降低的植物的产生
[0001] 本申请为申请号为200880110170. 8的分案申请，要求2007年8月15日的优先权。 发明领域
[0002] 本发明涉及产生转基因植物的方法。特别是，本发明涉及降低植物中亚硝酸盐含 量的方法以及通过该方法获得的转基因植物和相关用途。
[0003] 发明背景
[0004] 氮同化作用对于植物生长非常重要。在植物需要的所有矿物营养中，氮的需求量 最大。植物在田地中吸收氮的主要形式是硝酸盐和氨，它们是氮肥的主要成分。植物从土 壤中吸收硝酸盐或铵离子，取决于它们的可获得性。硝酸盐在含氧充足的非酸性土壤中更 丰富，而铵在酸性或渍水土壤中占优势。烟草的生长参数试验（St6hr, 1999)明确证实了 相对生长速率、叶绿素含量、叶面积和根面积随着硝酸盐供给的增加显著增加。
[0005] 根通过特异转运体的作用吸收硝酸盐和氨（Rothstein等，1998)。植物中存在对 硝酸盐具有不同亲和力的不同转运体系。接着硝酸盐或者被胞质酶硝酸还原酶（NR)还原 并进入氮同化途径或者被转运至木质部的枝条。硝酸盐从根的表皮细胞和皮层细胞转运至 维管系统进一步转运至枝条（Crawford, 1995)。它通过质外体进入叶并跨过质膜转运至叶 肉细胞。在这里它或者储存在液泡中或者在胞质中被还原并进入初级氮同化途径。当硝 酸盐过量时它储存于液泡中。这可作为渗压剂和硝酸盐吸收最少时待用的矿物N的来源 (Crawford和Glass, 1998)。胞质中存在的硝酸盐是初级氮同化的起点。
[0006] 硝酸盐在胞质溶胶中被胞质酶硝酸还原酶（NR)还原成亚硝酸盐，其自身被叶子 叶绿体或非光合器官质体中的亚硝酸还原酶（NiR)快速还原成铵（Crawford, 1995, Crete 等，1997, Tobin和Bowsher, 2005)。在叶绿体中铵接着进入谷氨酰胺合成酶/谷氨酸合酶 循环（GS/G0GAT)，在那里它掺入氨基酸库。
[0007] NR被认为是生长和硝酸盐同化的限速因子（Solomonson&Barber, 1990, Tischn er，2000)并且是氮同化的第一个关键步骤。它催化硝酸盐的2电子还原至亚硝酸盐，使用 NAD (P) H 作为电子供体（Wray 和 Kinghorn, 1989)。
[0008] 有三种形式的NR ;游离NR(活性）、磷酸化NR(活性pNR)和pNR:14-3-3(非活 性）。3种类型的比例随外部条件而变化（Kaiser等，2002)。这一复杂的NR调控控制了硝 酸盐的还原这样不会在细胞中积累有害量的亚硝酸盐（Lillo等，2003)。Lea等，（2006) 证明了烟草植物中NR的翻译后调控对NR活性和相关代谢物水平具有最大作用。采用组成 型启动子CaMV(35S)引入NR并因此在转录水平解除对NR的调节对代谢物水平几乎没有 影响，因为翻译后调控机制仍然具有活性。然而翻译后调控的丧失会引起嫩烟草叶的褪绿 病（Lillo等，2003)。在烟草中，定向突变Ser521至天冬氨酸可防止NR的翻译后磷酸化 (Kaiser等，2002, Lillo等，2003, Lea等，2006)。当这一翻译后调控已受到破坏时，NR的 组成型活化引起亚硝酸盐积累和褪绿病叶片。
[0009] NR的第二个功能为还原亚硝酸盐至一氧化氮和一氧化二氮。已知一氧化氮（N0) 在植物防御、生长和发育中具有重要的信号传导作用（Wendehenne等，2004)。NO产生只利 用1 %的NR能力并依赖于亚硝酸盐浓度（Kaiser等，2001，Rockel等，2002)。通过经纯化 的玉米NR从亚硝酸盐产生NO可被硝酸盐（50 y M)竞争性抑制并且当相对于亚硝酸盐还原 更高的硝酸盐还原引起亚硝酸盐水平积累时NO的产生速率增加（Rockel等，2002)。在亚 硝酸还原酶（NiR)活性严重降低的转基因烟草中报导了相应的NO释放增加。这也伴随着 参与硝酸盐还原调控的14-3-3蛋白质的合成增加（Morot-Gaudry-Talarmain等，2002)，并 有可能与控制细胞中亚硝酸盐潜在有害积累的尝试相关。
[0010] 亚硝酸还原酶（NiR)是硝酸盐同化途径中的第二个酶并涉及从被还原的铁氧还 蛋白转移六个电子至亚硝酸盐形成铵（Wray and Kinghorn, 1989)。绿叶中的NiR分子量为 63kDa并且是单体（Cr6t6等，1997)。NiR主要存在于C3植物叶子的叶绿体和C 4植物叶肉 细胞中的叶绿体，以及非绿色组织中的质体（Tobin和Bowsher, 2005)。
[0011] 已显示该酶为金属蛋白（Swarmy等，2005)并包含亚硝酸盐结合的西罗血红素 (sirohaem)辅基和可能为起始电子受体的4Fe/4S中心。
[0012] NiR由三个紧密折叠在辅因子周围的结构域、西罗血红素和4Fe/4S簇组成。NiR 与其电子供体铁氧还蛋白和底物亚硝酸盐形成复合物，4Fe/4S簇从铁氧还蛋白接受电子并 将它们转移至西罗血红素，其接着将电子转移至底物亚硝酸盐，其保持结合直至完全还原 至氨（Swamy 等，2005)。
[0013] NiR在细胞核中由NiR基因编码（Dorbe等，1998)，因此该蛋白质必须从胞质转移 至叶绿体。菠菜NiR前体蛋白比成熟蛋白长32个氨基酸。这些附加的氨基酸很可能是引 导NiR至叶绿体的转运肽序列（Wray和Kinghorn, 1989)，在叶绿体中这一肽必须裂解以形 成活性蛋白。
[0014] 在多种植物中鉴定了 NiR同种型。烟草中有四个NiR基因：NiRl和NiR3主 要编码叶特异性NiRs，NiR2和NiR4主要编码根NiRs (Kronenberger等，1993, Stohr 和Mack，2001)。在两个烟草祖先种中发现了这些基因的同系物，茸毛烟草（Nicotiana tomentosiformis)中的 NiRl 和 NiR2 以及林生烟草（Nicotiana sylvestris)中的 NiR3 和 NiR4(Kronenberger 等，1993)。
[0015] 在拟南芥菜、菠菜和大豆中只有一种NiR基因，玉米和尖辣椒中有两种，野生燕麦 中有三种（Wray和Kinghorn, 1989)。烟草NiR的叶和根mRNA比例为3:1 (Kato等，2004)， 表明叶NiR在硝酸盐同化中发挥更重要的作用。Kato等.（2004)采用定量RT-PCR也证明 了4种NiR基因各自的mRNAs均存在于叶和根中但是NiR2和4仅占叶总NiR mRNA的10%。 所有四种基因均在硝酸盐处理后被诱导。
[0016] Morot-Gaudry-Talarmain等（2002)产生了 NiR活性被严重抑制的反义NiR烟草 植物。这些植物显示显著降低的生长，表明植物中的亚硝酸盐细胞毒性可归因于活性氮种 类例如N0(-氧化氮）、N 20( -氧化二氮）和过亚硝酸盐的产生，它们进一步诱导蛋白质和 酚环结构中酪氨酸残基的硝化作用。N0释放增加了蛋白质例如14-3-3' s和亲环素的合成。
[0017] NiR活性需要为光合作用产物（Tobin和Bowsher，2005)并且发生在叶绿体基质中 的被还原的铁氧还蛋白作为电子供体。通过分离完整的菠菜叶绿体证明了亚硝酸盐还原可 由与完整叶中检测到的相似速率的光照引发。干扰PSII后的电子传递链并因此终止被还 原的铁氧还蛋白可获得性的DCMU (3 (3, 4-二氯苯基）-1，1-二甲基脲）抑制这一反应并显 示亚硝酸盐还原与非循环电子传递活跃地直接连接/偶合（Mohr和Schopfer，1994)。
[0018] 在根部，硝酸盐同化发生在白色体中。该反应与发生在叶绿体中的反应相似但 是由还原等价物（NADPH)通过氧化戊糖磷酸途径的铁氧还蛋白-NADPH氧化还原酶提供 (Tobin 和 Bowsher 2005)。
[0019] 铵掺入有机化合物是通过谷氨酰胺合成酶（GS)和谷氨酰胺-2-酮戊二酸-氨基 转移酶（G0GAT)的循环作用进行（Lea和Miflin，1974)。GS将铵掺入谷氨酰胺（Gin)并且 谷氨酸（Glu)是通过 G0GAT 的作用来源自 Gln(Lea 和 Miflin, 2003 ;Glevarec 等，2004)。 这一过程以循环进行，产生的一个谷氨酸分子被GS用作底物而另一个用于其他氨基酸的 合成。这一途径非常重要因为Glu和所产生的Gin是用于主要含N化合物生物合成的供体 (Hodges, 2002)。
[0020] 输入循环的为铵，其可源自数种不同的来源，例如初级硝酸盐同化、光呼吸作用和 氮再活化（remobilisation)(谷氨酸脱氢酶的脱氨活性），和底物2-酮戊二酸（2-0G)， 其可源自异柠檬酸脱氢酶或氨基转移酶，但是仍不清楚2-0G用于铵同化的准确路径 (Hodges, 2002)。
[0021]由氮同化生成的分子，谷氨酰胺（Gin)和谷氨酸（Glu)，是用于合成细胞中所有其 他氨基酸和含N化合物包括核酸、辅因子和叶绿素的氮（N)供体。因此Glu和Gin被称作 关键（pivotal)氨基酸，并且硝酸盐还原和GS/G0GAT循环位于氮和碳（C)代谢的交汇处。 N和C代谢必须紧密协调，因为N同化需要提供2-0G形式的C骨架、大量ATP以及还原硝酸 盐至铵必须的还原剂和将铵掺入Glu和Gin。这一紧密协调已在数个研究中通过N同化活 性和代谢物与光合碳同化途径的那些之间的强烈相关性显示出来（Martin等，2005)。在烟 草中，当植物遇到升高的C0 2水平时硝酸盐的吸收增强7% (Kruse等，2002)同时相对生长 速率增加9%。
[0022] 氮同化也与硫酸盐同化相关。硫与氮以这样的方式相互作用即一方的缺乏会降低 另一方的吸收和同化（Hesse等，2004)。来自暴露于硝酸盐的拟南芥菜植物的微阵列数据 证明了数种硫酸盐转运体和同化基因响应硝酸盐处理（Wang等，2003)的表达与硝酸盐转 运体和同化基因上调的方式相同。确实，亚硫酸还原酶（SiR)和NiR包含电子转移必需的 西罗血红素辅因子和铁硫簇。也已知SiR和NiR可还原其他酶的底物但是对它们自己的底 物具有更高的亲和力（Swamy等，2005)。因此N同化活性尤其是NiR活性依赖于硫的存在 (Swamy 等，2005)。
[0023] 氮（主要是铵和氨基酸的形式）也可通过再循环氮的途径为植物所用，例如光呼 吸作用、衰老和氨基酸分解代谢中达到的那些。当通过线粒体酶甘氨酸脱羧酶（GDC)转化 甘氨酸至色氨酸的过程中从(： 3植物叶子的甘氨酸释放铵时发生光呼吸作用。光呼吸作用 途径可导致铵同化速率是硝酸盐还原的速率的10倍，尤其是当环境条件例如干旱导致气 孔闭合和叶绿体中二氧化碳利用率低时。
[0024] 在衰老过程中，蛋白水解后释放的氨基酸发生氨基转移，使得氨基基团转移 至Glu。由谷氨酸脱氢酶（GDH)催化的氧化脱氨反应接着使可以释放铵、2-0G和还原力 (NADH)。接着铵可作为谷氨酰胺和天冬酰胺合成的底物并且2-0G在三羧酸循环中被代谢 (Gleverac 等，2004)。
[0025] 理论上⑶H可在胺化方向中发挥作用从铵和2-0G合成谷氨酸。GDH在铵同化中的 作用一直以来并将继续存在很大争议。然而，目前有许多证据表明GDH主要以脱氨方向在 具有低C/N比例的组织例如发芽的种子和衰老的叶子中发挥作用（即转化氨基酸至转运化 合物）（Mifiin 和 Habash, 2002)。
[0026] NR和NiR活性的调控在控制整个植物的初级氮同化中是关键性的并对植物的生 长和发育具有重要影响。然而在某些条件下硝酸盐可能积累，主要在绿色光合活性组织中， 在那里其储存在叶肉细胞的液泡中。在低温和/或太阳照射时段（例如在冬季的温