专利名称：黄瓜亚硝酸盐主效qtl紧密连锁的分子标记方法
技术领域：
本发明涉及黄瓜育种及分子生物学领域，尤其是选择利用与黄瓜亚硝酸盐主效 QTL紧密连锁的分子标记进行辅助育种，以提高黄瓜品质育种效率。
背景技术：
亚硝酸盐是影响蔬菜质量的重要因素之一，在人体内会引起高铁血红蛋白症，还能与人体次级胺结合，形成亚硝胺，有致癌作用(张夫道，200 。有研究表明，中国大部分地区蔬菜中亚硝酸盐的污染已不容忽视。蔬菜中亚硝酸盐含量国家标准，以NaNO2彡4. Omg kg-1 (GB184061-2001)。为了人民群众的安全健康，应加快选育低亚硝酸盐含量的黄瓜品种。但是黄瓜中亚硝酸盐含量的测定，要等果实发育到成熟期才能进行；且测量方法比较繁琐；况且表现型与基因型之间缺乏明确的对应关系，选择效率不高。近年来分子标记辅助育种技术，有效地解决了这一问题。通过构建遗传连锁图谱和数量位点(QTL)分析，能够检测到与黄瓜亚硝酸盐主效QTL紧密连锁的分子标记。使用与这一特定亲本的亚硝酸盐主效QTL紧密连锁的分子标记，可以对该特定亲本的后代或其衍生品种(品系)在苗期进行早世代筛选，淘汰高亚硝酸盐的品种(品系)，节约生产成本， 提高育种效率。黄瓜分子标记成功申请专利已有很多先例。例如徐向丽等发明了一种与黄瓜雌性性状相关的分子标记(公告号CN101113469)，潘俊松发明了与黄瓜单性花基因M共分离的分子标记(公告号CN101580876)，刘龙洲等发明了与黄瓜白粉病抗性主效QTL紧密连锁的分子标记(公告号CN101240342)，关媛等发明了与黄瓜有毛基因Gl紧密连锁的分子标记 (公告号:CN101250523)。D0327是东北农业大学园艺学院黄瓜课题组选育的优良亲本(果皮绿色均勻、光皮、无刺瘤、果柄极短)，其亚硝酸盐含量经3年5点测验低于4. Omg · kg—1。目前尚未有与其主效QTL相连锁分子标记的报道。
发明内容
本发明目的是提供一种方法，用以检测与黄瓜亚硝酸盐主效QTL紧密连锁的分子标记，并通过这些分子标记来预测黄瓜亚硝酸盐的水平，提高育种速度和加快育种进程。本发明提供的与黄瓜亚硝酸盐主效QTL紧密连锁的分子标记，是通过以下方法获得a亚硝酸盐含量低的黄瓜品种D0327 (2. 56mg · kg—1)作父本与亚硝酸盐含量高的黄瓜品种1058(8. 92mg · kg—1)作母本进行杂交，得到杂种F1 ；b由杂种F1代自花授粉获得F2代；c分离每个单株黄瓜叶片的DNA，采用简单重复序列标记(SSR)引物进行PCR扩增，6 %丙烯酰胺凝胶上电泳分离，获得分子标记数据；
d基于遗传连锁交换定律，对分子标记分析资料构建黄瓜遗传连锁图；e在果实收获以后，测定F2代每个单株果实的亚硝酸盐，2. 6mg · kg-1以上为高亚硝酸盐型，2. 6mg · kg-1以下为低亚硝酸盐型，f将F2代每个单株果实的亚硝酸盐与黄瓜遗传连锁图谱进行连锁和QTL分析，将 LOD彡3. 0作为QTL存在的阙值，确定与黄瓜亚硝酸盐主效QTL连锁的分子标记CSWTA17。与黄瓜亚硝酸盐主效QTL紧密连锁的分子标记的应用包括将分子标记SCSWTA17 应用于黄瓜品种和品系的基因检测，以判断该品种和品系亚硝酸盐的水平。a以D0327及其衍生品种或品系为父母本与其他黄瓜品种杂交并繁衍至F2以上，b对通过步骤a获得黄瓜单个植株，分离叶片DNA，检测分离的DNA中是否存在与黄瓜亚硝酸盐主效QTL紧密连锁的分子标记，如果分子标记出现，则可预测黄瓜亚硝酸盐含量在2. 6mg · kg-1以下。所用D0327及其衍生品种或品系，是指以D0327为亲本，通过常规杂交方法获得的黄瓜品种或品系。本发明能够克服黄瓜亚硝酸盐含量只能在果实成熟期进行检测的缺点，在苗期就能够通过分子标记对黄瓜品种和品系的亚硝酸盐水平进行预测和筛选，淘汰高含量植株，减少人力和物力的浪费，提高育种效率。
附图1是构建的黄瓜遗传连锁图，标记间的距离已用数字标出。此连锁组共含有 4个SSR标记，亚硝酸盐QTL记为Ni，位于连锁组的CSWTA04-CSWTA17区间内，距标记的最近距离1. 8cM。
具体实施例方式实例与黄瓜亚硝酸盐主效QTL紧密连锁的分子标记的获得(I)F2群体的构建及亚硝酸盐含量的测定采用亚硝酸盐含量低的黄瓜品种D0327 (2. 56mg · kg—1)作父本与亚硝酸盐含量高的黄瓜品种1058(8. 92mg · kg—1)作母本进行杂交，得到杂种F1 ；由杂种F1代自花授粉获得 F2代；产生240个单株。摘取相同开花期相同节位的成熟商品瓜，洗净吸干水分后切段，用勻浆机搅碎。准确称取5. Og,装入25毫升刻度试管中，加去离子水IOml，盖上玻璃塞，置于沸水浴中提取30 分钟，冷却后过滤并用去离子水定容至25ml。吸取提取液2. Oml，加1 %磺胺溶液4ml，摇勻。 反应5min后，加4. OmlO. 02%盐酸萘乙二胺后摇勻，室温下放置30min后在540nm的波长下比色。比色阶段进行三次重复。(2)分子标记分析，遗传图谱构建及QTL分析选取在父母本间具有扩增多态性的SSR引物对240个单株进行分析，根据SSR条带在群体中的分离情况，将有母本类型条带的个体记为“A”，有父本类型条带的个体记为 “B”，杂合类型条带的个体记为“H”，缺失不清的记为“_”。
利用Mapmaker/EXP3. 0作图软件，构建分子标记连锁图谱。应用Group命令进行连锁分析和分组(L0D = 5. 0)，连锁标记少于8个的用Compare命令进行优化排序，多于8 个的用Ripple命令排序，错误检测水平设为1 %，利用Kosambi函数将重组率转化为遗传图距(cM)。将LOD彡3. O作为QTL存在的阙值，用WinQTLcartograph V2. O进行QTL定位。与黄瓜亚硝酸盐主效QTL紧密连锁的分子标记CSWTA17 采用引物CSWTA17进行 PCR扩增，扩增在6%的聚丙烯凝胶(100毫升聚丙烯凝胶含有5. 7克丙烯酰胺，0. 3克双丙酰胺)电泳上分离后，获得分子标记，所得片段为198bp。
权利要求
1.与黄瓜亚硝酸盐主效QTL紧密连锁的分子标记，是通过以下方法获得的a亚硝酸盐含量低的黄瓜品种D0327(2.56mg· kg—1)与亚硝酸盐含量高的黄瓜品种 1058(8. 92mg · kg-1)作母本进行杂交，得到杂种F1 ； b由杂种F1代自花授粉获得F2代；c分离每个单株黄瓜叶片的DNA，采用简单重复序列标记(SSR)引物进行PCR扩增，6% 丙烯酰胺凝胶上电泳分离，获得分子标记数据；d基于遗传连锁交换定律，对分子标记分析资料构建黄瓜遗传连锁图； e在果实收获以后，测定F2代每个单株果实的亚硝酸盐，2. 6mg -kg-1以上为高亚硝酸盐型，2. 6mg · kg-1以下为低亚硝酸盐型，f将F2代每个单株果实的亚硝酸盐与黄瓜遗传连锁图谱进行连锁和QTL分析，将 LOD彡3. 0作为QTL存在的阙值，确定与黄瓜亚硝酸盐主效QTL连锁的分子标记CSWTA17。
2.权利要求1所述与黄瓜亚硝酸盐主效QTL紧密连锁的分子标记，其特征在于用黄瓜叶片，采用引物CSWTA17进行PCR扩增，扩增在6 %的聚丙烯凝胶(100毫升聚丙烯凝胶含有 5. 7克丙烯酰胺，0. 3克双丙酰胺)电泳上分离后，获得分子标记，所得产物为198bp。
3.如权利1和2所述的分子标记的应用，其特征在于a以D0327及其衍生品种或品系为父母本与其他黄瓜品种杂交并繁衍至F2以上， b对通过步骤a获得的黄瓜单个植株，分离叶片DNA，检测分离的DNA中是否存在与黄瓜亚硝酸盐主效QTL紧密连锁的分子标记，如果分子标记出现，则可预测黄瓜亚硝酸盐在 2. 6mg · kg-1 以下。
4.根据权利3所述的分子标记的应用，其特征在于将分子标记用于黄瓜品种或品系的基因检测，以判断该品种或品系的亚硝酸盐是否在2. 6mg · kg-1以下。
5.根据权利3和4所述的分子标记的应用，其特征在于所用D0327及其衍生品种或品系，是指以D0327为亲本，通过常规杂交方法获得的黄瓜品种或品系。
全文摘要
本发明是一种黄瓜亚硝酸盐主效QTL紧密连锁的分子标记方法，属于黄瓜育种和分子生物学领域。将亚硝酸盐含量低的黄瓜品种D0327(2.56mg·kg-1)作父本与亚硝酸盐含量高的黄瓜品种1058(8.92mg·kg-1)作母本进行杂交，对F2的每个单株的基因型与每个单株的果实亚硝酸盐数据进行遗传连锁分析，获得与D0327亚硝酸盐主效QTL紧密连锁的分子标记CSWTA17。通过检测D0327及其衍生品种(品系)的DNA是否含有分子标记CSWTA17，可预测亚硝酸盐水平，从而加快低亚硝酸盐黄瓜新品种的选育速度。
文档编号C12N15/10GK102311949SQ20101022182
公开日2012年1月11日 申请日期2010年7月9日 优先权日2010年7月9日
发明者周秀艳, 王桂玲, 秦智伟 申请人:东北农业大学