目标外源DNA即嵌合基因的二元载体通过共 培养农杆菌和来自目标植物的外植体从适当的农杆菌株转移至目标植物。接着使转化的植 物组织在筛选培养基上再生，该筛选培养基包含筛选标记和植物生长激素。另一选择为花 浸蘸法（Clough&Bent，1998)，通过该方法使完整植物的花芽与包含嵌合基因的农杆菌株混 悬液接触，在结实之后，被转化的个体发芽并通过在筛选培养基上的生长进行鉴定。用农杆 菌直接感染植物是一种被广泛应用的简单技术，其描述于Butcher D.N.等，（1980)，Tissue Culture Methods for Plant Pathologists, D.S. Ingrams和 J.P.Helgeson编辑，203-208。
[0161] 其他适当的转化方法包括采用例如聚乙二醇或电穿孔技术、粒子轰击、显微注射 和使用碳化硅纤维直接将基因转移至原生质体。
[0162] 采用冲击（ballistic)转化进行植物转化，包括碳化娃晶须技术，教授于Frame BR, Drayton PR, Bagnaall SV, Lewnau CJ, Bullock WP, Wilson HM, Dunwell JM, Thompson JA&Wang K(1994)中。通过碳化硅晶须介导的转化产生可育的转基因玉米植物教授于The Plant Journal 6:941-948)，病毒转化技术教授于例如 Meyer P,Heidmann I&Niedenhof 1(1992)。使用木薯花叶病毒作为用于植物的载体系统教授于Gene 110:213-217。关于植 物转化的其他教导见EP-A-0449375。
[0163] 另一方面，本发明涉及携带编码亚硝酸还原酶的核苷酸序列的载体系统以及将其 引入生物体例如植物的基因组中。该载体系统可包含一种载体，但它也可包含两种载体。在 两种载体的情况下，该载体系统通常称作二元载体系统。二元载体系统进一步详细描述于 Gynheung An 等，（1980)，Binary Vectors, Plant Molecular Biology Manual A3,1-19。
[0164] 一种普遍采用的植物细胞转化系统使用来自根癌农杆菌的Ti质粒或来自发根农 杆菌（Agrobacterium rhizogenes)的 Ri 质粒 An 等，（1986), Plant Physiol. 81, 301-305 和 Butcher D.N?等，（1980)，Tissue Culture Methods for Plant Pathologists, D. S. Ingrams和J. P. Helgeson编辑，203-208。在本发明所需外源基因的各种引入植物的方 法后存在和/或插入其他DNA序列可能是必要的。例如，如果使用Ti-或Ri-质粒转化植 物细胞，则可连接至少Ti-和Ri-质粒T-DNA的右边界，且通常可连接右边界和左边界， 作为引入基因的侧翼区。对T-DNA在植物细胞转化中的用途已进行了大量研究并描述于 EP-A-120516 ；Hoekema, The Binary Plant Vector System Offset-drukkeri j Kanters B.B.,Alblasserdam，1985,第五章；Fraley,等，Crit.Rev.Plant Sci,4:l_46;和 An 等，EMB0 J. (1985)4:277-284。
[0165] 用编码亚硝酸还原酶的外源基因转化的植物细胞根据熟知的组织培养方法使其 生长和维持，例如通过在适当的添加了必要生长因子例如氨基酸、植物激素、维生素等的培 养基中培养细胞。
[0166] 与本发明相关的术语"转基因植物"包括包含编码本发明亚硝酸还原酶的外源基 因的任何植物。优选该外源基因整合入该植物的基因组中。
[0167] 术语"转基因植物"和"嵌合基因"不包括受控于也存在于其天然环境中的它们的 天然启动子的它们天然环境中的天然核苷酸编码序列。
[0168] 一方面，本发明的核酸序列、嵌合基因、植物转化载体或植物细胞为分离形式。术 语"分离的"指该序列至少基本不含与该序列在天然状态下或在天然状态中发现时相关的 至少一种其他成分。
[0169] 一方面，本发明的核酸序列、嵌合基因、植物转化载体或植物细胞为经纯化的形 式。术语"纯化的"指一种相对纯状态-例如至少约90%纯，或至少约95%纯或至少约98% 纯。
[0170] 用本发明外源基因转化的植物包括与园艺工业、花卉工业、林业和/或农业相关 的那些。该植物可为生长用于提供切花目的的植物。该植物可为番茄、黄瓜、碧冬茄属 (Petunia)、石竹属（Dianthus)、云杉属（Picea)、松属（Pinus)、桉属（Eucalyptus)、杨属 (Populus)，双子叶物种例如马铃薯、烟草、棉花、莴苣、茄子、甜瓜、南瓜、豌豆、油菜、大豆、 甜菜或向日葵，或单子叶物种例如小麦、大麦、黑麦、稻或玉米。更优选该植物为茄科。更优 选该植物为Cestroideae亚科。更优选该植物为番爺、马铃薯、爺子、碧冬爺属或烟草的一 种或更多种。更优选该植物为烟草属。最优选该植物为烟草。编码亚硝酸还原酶的适当外 源基因也可获自这些物种。
[0171] 本发明也包括与本文所讨论的序列互补的核苷酸序列或任何衍生物、片段或其衍 生物的用途。如果该序列与其片段互补那么该序列可用作鉴定其他生物体中相似编码序列 的探针等等。
[0172] 如本文所使用，术语"变异体"指非内源遗传密码表达的蛋白，当与成熟蛋白质序 列内天然或野生型序列比较时引起一个或更多个氨基酸改变（即氨基酸缺失、添加或替 换）。 实施例
[0173] 现参考以下实施例仅以举例方式描述本发明。
[0174] 收获的叶材料中残留的硝酸盐/亚硝酸盐可导致有害化合物例如N-亚硝胺的形 成。这些与数种人类癌症例如消化道癌、肝癌、肺癌和肾癌相关（Ellis等，1998)。主要的 亚硝基化剂为亚硝酸盐（Morikawa等，2004)。在以下实施例中，本发明人预通过控制NiR 的活性影响细胞中亚硝酸盐的累积。特别是本文证明了在一个实施方案中可通过增加烟草 中叶绿体亚硝酸还原酶的活性降低叶子的亚硝酸盐含量。
[0175] 选择适当的候选基因整合入烟草植物的基因组中。该基因需要与适当的启动子/ 调控序列偶联，这取决于该基因在转基因植物中所需的表达位点和时间。为了影响硝酸盐 /亚硝酸盐的积累候选基因应为初级氮同化基因例如NiR。为了降低叶中的残留硝酸盐，该 基因的过表达提供增强的能力同化细胞中的硝酸盐和亚硝酸盐。
[0176] 如上文所述，植物中硝酸盐还原酶的过表达导致亚硝酸盐水平有害性积累。本发 明发明人假设NiR过表达为防止硝酸盐供给过多的有害效应的更适当的备选方法，因为氨 的任何潜在积累将比亚硝酸盐的积累更容易被耐受。
[0177] 引入包含与内源序列同源的序列的转基因可引起共抑制（Cr6t6和 Vaucheret，1999)。因此在以下优选的实施方案中，引入在核苷酸水平与烟草的内源亚硝酸 还原酶不相同或相似的转基因。在本研究中，分离NiR(拟南芥菜）基因并在香石竹蚀环病 毒组成型启动子（CERV(Hull等，1986))的控制下引入烟草植物中。对所得转基因植物进 行详细的生理学、生物化学和分子学分析。
[0178] 在植物遗传修饰中，通常在根癌农杆菌的辅助下将完整的DNA分子整合入细胞 的核基因组。这些细胞再生形成愈伤组织，加入植物激素后可通过已确立的组织培养操 作（Hansen等，1994)使愈伤组织产生可育的成熟植物。农杆菌介导的转化可以整合转移 DNA(或T-DNA)的大片段至基因组并引起最小的重排。它通常转移插入基因的一至五个拷 贝并具有高转化效率（Hansen和Wright, 1999)。
[0179] 可阻止整合转基因表达的植物防御系统内操作的机制包括DNA甲基化和RNA干扰 (RNAi)。由于这些基因沉默机制，在以下实施例中鉴定在烟草中过表达而没有被沉默的候 选NiR基因。在这一实施例中，鉴定与内源烟草NiRs具有最小同源性的NiR基因。
[0180] NiR基因的数量随植物物种变化：拟南芥菜、稻、辣椒和菠菜具有一个，玉米中有 两个，而烟草比较独特具有四个。这归因于烟草基因组的四倍体特性，它从两个烟草祖先种 林生烟草和茸毛烟草融合演化而来。在茸毛烟草中发现了 NiRl和NiR2基因的同系物，在 林生烟草中发现了 NiR3和NiR4的同系物（Kronenberger等，1993)。
[0181] GenBank中有烟草、拟南芥菜、菠菜、稻和辣椒的全长NiRcDNA序列。仅有玉米的部 分cDNA序列。八个NiR蛋白质序列均具有相似的0RF长度、分子量和等电点，但是pH7时 的电荷具有显著差异。这些序列包括将NiR蛋白靶向叶绿体或质体的转运肽。在转移至叶 绿体后，转运肽裂解。使用基于网站http:/www. cbs. dtu. dk/services/TargetP的服务器 预测各序列的转运肽长度。结果显示于表1。
[0182]
【主权项】
1. 一种产生相对于未修饰的植物亚硝酸盐含量降低的转基因植物的方法，所述方法 包括向未修饰的植物中引入编码亚硝酸还原酶的外源基因，其中该外源基因编码的亚硝酸 还原酶的表达相对于未修饰的植物降低了该转基因植物中的亚硝酸盐含量，并且其中所述 未修饰的植物为烟草，其中所述外源基因包含SEQ ID NO :2定义的核酸序列，或其编码与 SEQ ID NO :3定义的多肽具有至少95%氨基酸序列同一性的功能性亚硝酸还原酶的变异 体。
2. 任一项前述权利要求的方法，其中由所述外源基因编码的亚硝酸还原酶与未修饰 植物中内源基因编码的亚硝酸还原酶具有小于90%的氨基酸序列同一性。
3. 任一项前述权利要求的方法，其中所述编码亚硝酸还原酶的外源基因与能够引导 该外源基因在该植物中组成型表达的启动子序列相连。
4. 权利要求3的方法，其中所述启动子序列为来源自香石竹蚀环病毒的组成型启动 子。
5. 任一项前述权利要求的方法，其中通过引入外源基因生成第一代转基因植物，从第 一代转基因植物产生第二代转基因植物。
6. 权利要求5的方法，其中所述第二代转基因植物由第一代转基因植物自体受精产 生。
7. 权利要求6的方法，其中所述第二代转基因植物对于所述编码亚硝酸还原酶的外 源基因是纯合的。
8. 任一项前述权利要求的方法，其中通过引入外源基因生成的第一代转基因植物包 含该外源基因的单个拷贝。
9. 任一项前述权利要求的方法，其中由所述外源基因编码的亚硝酸还原酶在所述转 基因植物的叶中表达。
10. 任一项前述权利要求的方法，其中所述转基因植物的亚硝酸盐含量相对于未修饰 植物降低了至少10%。
【专利摘要】本发明涉及亚硝酸盐含量降低的植物的产生。本发明一方面涉及产生转基因植物的方法，该方法包括向未修饰的植物中引入编码亚硝酸还原酶的外源基因，其中由所述外源基因编码的亚硝酸还原酶的表达相对于未修饰植物降低了转基因植物的亚硝酸盐含量。本发明也提供包含编码亚硝酸还原酶的外源基因的转基因植物和植物细胞，以及相关用途、嵌合基因和植物转化载体。
【IPC分类】C12N15-84, A01H5-00
【公开号】CN104673828
【申请号】CN201510076085
【发明人】S.达文波特, M.莫恩德斯
【申请人】英美烟草(投资)有限公司
【公开日】2015年6月3日
【申请日】2008年8月14日
【公告号】CN101815787A, EP2176417A1, US20110239324, WO2009022183A1