二化螟内源小rna在水稻抗虫改良中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及二化螟内源小RNA在水稻抗虫改良 中的应用。克隆得到一条二化螟[Chilo suppressalis (Walker)]内源小RNA序列，对该 序列的功能验证和在水稻抗虫改良中的应用研究。
【背景技术】
[0002] 水稻是世界上主要粮食作物之一，约有一半的世界人口以其为主食。在农业生产 上，病虫害会导致水稻生产的大规模减产，造成巨大的经济损失。二化螟是水稻的主要害 虫之一，广泛分布于亚洲、大洋洲、北非、南欧等国家；在我国除青海和西藏外，各省均有二 化螟的发生(盛承发等2003)。近年来，二化螟的危害在我国多数稻区呈上升趋势（陈豪等 2010)。在水稻生产上，化学试剂是二化螟防治的主要手段，但人们也在积极探索其他更经 济和低环境危害的方法。Bt基因在水稻上的应用对于鳞翅目的二化螟有较好的防治，但其 他新的方法也在不断被尝试以备二化螟在Bt水稻筛选压下产生抗性。
[0003] RNA干涉现象（RNA interference, RNAi)最早在牵牛花中被发现（Napoli et al. 1990)，并由Fire等人明确将其名为RNAi (Fire et al. 1998)。RNAi的机制被发现后， 广被泛运用在基因治疗、功能基因组研究和品种改良中。近年来，人们尝试用RNAi技术在 植物抗虫育种方面进行应用，Mao等人用表达dsRNA的转基因拟南芥和烟草喂饲棉铃虫，发 现其植株对棉铃虫具有抗性（Mao et al.2007);Baum等人用人工合成的dsRNA喂饲西部玉 米根虫（western corn rootworm)，12h到Id后，害虫的目标基因表达显著下降（Baum et al. 2007)。
[0004] Mi RNA是一类长约21~28nt的非编码（non-coding) RNA (Lagos-Quintana et al.2001;Lau et al.2001;Lee and Ambros2001;Couzin2002)，来源于60~80nt的发夹前 体pre-miRNA。一般pre-miRNA的长度在动物中比较恒定，但在植物中其长度的变化性较 大，可以从几十到几百nt (Reinhart et al.2002;LAG0S-QUINTANA et al. 2003)。miRNA 的主要功能是在生物体生长和发育过程中起着基因表达调控的作用，如在线虫的miRNA lin-4通过与靶标mRNA的3'末端的非翻译区不完全配对来对靶标mRNA进行翻译后抑制， lin_4的突变往往造成线虫发育形态的改变（Banerjee and Slack2002;Pasquinelli and Ruvkun2002)新miRNA的发现可通过直接克隆或生物信息学分析得到。其中直接克隆的方 法耗时耗力，人们更倾向于通过生物信息学的方法来发现新miRNA。生物信息学的方法需 要依靠高通量测序技术，它能一次对几十万到几百万条的DNA分子进行序列测定。采用 边合成边测序（sequencing by synthesis)的策略可减少因二级结构造成的区域缺失，并 具有所需样品量少，高通量，高精确性，拥有简单易操作的自动化平台和功能强大等特点。 目前，不少物种已经通过高通量测序的方法发现了很多新的miRNA并上传至miRNA数据 库miRBase (Kozomara and Griffiths_Jones2011)，如通过小RNA高通量测序，在幢虫中 发现55个miRNA序列（Wen et al. 2009)，在松材线虫中确定出37个新miRNA (Huang et al. 2010)，在家猪中的10个样本中发现了777条新的miRNA (Li et al. 2010)等。
[0005] 利用天然的植物miRNA前体作为骨架，把人工设计的针对目标基因的21nt的 序列替换相应的天然miRNA序列，依循天然miRNA的生物学形成机制可生成成熟的人工 miRNA (artificial microRNA, amiRNA)。然后amiRNA可以和天然miRNA-样特异性地 沉默目标基因的表达。目前，在拟南芥、烟草、番茄、水稻、苔藓以及藻类等多种植物中均 已成功应用amiRNA技术特异性地抑制内源或外源基因的表达（Niu et al. 2006; Schwab et al.2006;Qu et al.2007;Khraiwesh et al.2008;ffarthmann et al.2008;Molnar et al. 2009)。amiRNA干涉与dsRNA干涉相比具有更高的特异性，不易引起"脱靶"的现象，被誉 为"第二代"基因沉默技术（Tang etal. 2007)。目前该技术广泛运用在功能基因组研究、品 种改良和医疗领域，但amiRNA技术运用于转基因抗虫育种还未见报道。本发明运用amiRNA 技术，将二化螟体内源小RNA片段在转基因水稻中过量表达。通过二化螟喂饲试验，发现该 转基因水稻具有一定的抗二化螟效果，该研究为植物转基因抗虫育种制提供了新思路，也 为深入了解miRNA干涉的机制提供了帮助。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，利用高通量测序技术和生物信息学鉴定 出二化螟内源的特异小RNA csu-15,利用csu-15的序列体外构建相应的amiRNA表达载体， 并通过农杆菌介导的遗传转化方法转化到水稻品种中花11中，转基因中花11过量表达与 csu-15序列一致的amiRNA，二化螟取食转基因水稻后，摄入大量的amiRNA，由于amiRNA与 内源小RNA csu-15的序列一致，可能导致二化螟的体内相应基因调控的紊乱，达到影响二 化螟生长发育，从而起到抗虫的效果。
[0007] 本发明的技术方案如下：
[0008] 1.收集二化螟6个不同生长发育时期的样本，包括卵、1-2龄幼虫、3-4龄幼虫、5 龄幼虫、蛹和成虫，用Trizol试剂分别抽提6个样本的总RNA (见实施例1)。
[0009] 2.将收集到的二化螟6个样本的总RNA送华大基因公司进行小RNA高通量测序， 通过生物信息学方法分析，预测出6个样本中保守的miRNA、rRNA、scRNA、snoRNA、snRNA、 tRNA、piRNA等小RNA，同时分析6个样本中未发现的新miRNA，以及它在6个样本中的表 达情况(见实施例2)。其中csu-15是一个预测的新miRNA，它在二化螟的中肠组织中存在， 其序列如序列表SEQ ID N0:1所不，其天然如体序列如序列表SEQ ID N0:2所不。
[0010] 3.对预测出的CSU-15,通过茎环RT-PCR以及对RT-PCR产物再次测序可以验证 csu-15真实的存在于二化螟体内（见实施例3)。
[0011] 4.根据Warthmann等（2008)的报道，根据csu-15的序列体外构建相应的amiRNA 表达载体(见实施例4)，并用农杆菌介导的转化方法导入水稻品种中花11(见实施例5)，得 到转基因水稻植株。
[0012] 5.对转基因水稻植株进行阳性检测以及amiRNA表达量检测后(见实施例6)，选取 amiRNA表达量高的植株进行二化螟接虫鉴定(见实施例7)，得到对二化螟生长有明显抑制 效果的转基因植株。
[0013] 本发明具体技术方案如下：
[0014] 一种抑制水稻害虫二化螟生长的小RNA csu-15基因在培育转基因抗虫水稻中的 应用，该基因的核苷酸序列如SEQ N0 :1所示。
[0015] 上述基因所述的应用的具体步骤包括：
[0016]利用 csu-15 基因序列设计扩增引物 15-I、15-II、15-III、15-IV、G4368 和 G4369,然后用两轮PCR合成csu-15人工miRNA的前体基因，并将该前体基因构建到 pC1300-Ubi_Nos载体上，得到重组质粒pUbi-ami_csul5,用该重组质粒转化水稻材料中花 11，将获得的转基因的水稻材料命名为水稻ZHll-csul5, Oryza sativa L.ZHll-csul5,于 2013年11月29日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏号为 CCTCC NO ：P201307 ；
[0017] 其中：csu-15人工miRNA前体基因的核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示；
[0018] 所述的15-1、15-11、15-111、15-IV、G4368和G4369引物序列的核苷酸序列如下所 示：
[0019] 15-1 agTATAACTATAGATAGTACAGTcaggagattcagtttga (5' _3，）；
[0020] 15-11 tgACTGTACTATCTATAGTTATActgctgctgctacagcc (5，_3，）；
[0021] 15-III ctACTGTTCTAACTATAGTTATAttcctgctgctaggctg (5，_3，）；
[0022] 15-IV aaTATAACTATAGTTAGAACAGTagagaggcaaaagtgaa (5' _3'）；
[0023] G-4368CTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAAC (5，_3，）；
[0024] G-4369GCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAG (5，_3，）；
[0025] 所述的重组质粒pUbi-ami_csul5含有SEQ ID N0 :3所不的csu-15人工miRNA前 体基因；
[0026] 所述PCR方法如下所述：
[0027]使用引物组合 G-4368+15-II、15-I+15-IV 和 15-III+G-4369 以质粒 pNW55 为模板 进行第一轮PCR反应，反应体系为：10Xpfu Taq buffer2. 0iil，dNTPs2. OiU，左、右引物各 0? 2 u 1，pNW5510ng，pfu TaqO. 2 u 1，灭菌双蒸水至 20 u 1;
[0028]反应条件：95°C 2min ;95°C 30s，55°C 30s，72°C 30s，30 个循环；72°C 7min。
[0029] 将PCR产物于0. 8%琼脂糖胶电泳，挖胶后回收PCR产物，最后溶于20 ill灭菌双 蒸水；用回收的第一轮PCR的三种PCR产物进行第二轮PCR;
[0030] 第二轮PCR使用G-4368+G-4369引物组合，反应体系为：10XEx Taq buffer2. 0 ii 1，dNTPs2. 0 ii 1，G-43680. 2 ii 1，G-43690. 2 ii 1，第一轮 PCR 产物等量混合 L 0 y 1, Ex Taq
[0031] 0? 2 ill,灭菌双蒸水至 20 ill;
[0032]反应条件：95°C 2min ;95°C 30s，55°C 30s，72°C lmin，30 个循环；72°C 7min;最 终PCR产物克隆于T载体pEASY-T3上，然后测序验证；利用BamH I和Kpn I酶切含有 csu-15amiRNA前体基因的T载体，并释放出的前体基因克隆于载体pC5300-Ubi-tNos上获 得最终表达载体pUbi-ami_csul5。
[0033] 本发明的优点在于：
[0034] 1