二化螟致死基因csu-miR-9b及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于农业生物技术领域，涉及二化螟致死基因csu-miR-9b及其应用。
【背景技术】
[0002] 二化螟Chilosuppressalis(Walker)属鳞翅目，螟蛾科，是我国水稻上危害最为 严重的常发性害虫之一。在我国，化学药剂连续单一长期使用已导致二化螟对多种农药产 生了不同程度的抗性，需要不断加大农药使用量才能达到满意的防治效果，造成了更为严 重的环境污染，形成恶性循环。因此，在农业生产实践中，急需化学农药之外的替代防治手 段。
[0003] microRNAs(miRNAs)是一种小的，类似于siRNA的分子，由高等真核生物基因组编 码，miRNA通过和靶基因mRNA碱基配对引导沉默复合体（RISC)降解mRNA或阻碍其翻译， 从而在转录后水平调控生物的生长、发育、代谢。miRNAs在物种进化中相当保守，在植物、 动物和真菌中发现的miRNAs只在特定的组织和发育阶段表达，miRNA的组织特异性和时序 性，决定组织和细胞的功能特异性，表明miRNA在细胞生长和发育过程中起多种调节作用。
[0004] 在生物体中，一些重要的基因对维持生命是必须的。因此，从理论上而言，如果利 用miRNA类似物将农业害虫中重要基因的表达进行干扰，则会引起害虫的致畸或致死，从 而达到控制害虫的目的。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供二化螟致死基因csu-miR-9b。
[0006] 本发明的另一目的是提供该二化螟致死基因csu-miR_9b的应用。
[0007] 本发明的目的可通过如下技术方案实现：
[0008] 二化螟致死基因csu-miR-9b，序列为 5' -UCUUUGGUUAUCUAGCUGUAUGA-3'（SEQID NO. 1)〇
[0009] 所述的Csu-miR_9b是通过以下生物信息学方法分析发现的：
[0010] ⑴去除被污染的序列与无义序列，过滤掉短于18nt的序列，得到可标注的干净 数据；
[0011] (2)使用Genbank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)进行序列比对，使 用Rfam(http://rfam.sanger.ac.uk)去除正义外显子、反义外显子、正义内含子、反义内 含子、rRNA、tRNA等。使用RepBase(www.girinst.org/repbase)去除重复序列；
[0012] (3)在已知二化螟基因组（http://ento.njau.edu.cn/ChiloDB/)的情况下，使用 miRDeep预测miRNA。先用MegaBlast(http://www.mega-blast.com/)将处理后的小RNA 文库序列映射到基因组上，再使用miRDe印，以默认参数进行miRNA预测；
[0013] (4)为了分析miRNA的家族与保守性，我们使用Patscan，以211参数将二化螟成 熟体miRNA与miRBaseversion19. 0上的已知miRNA进行比对，最终获得Csu_miR-9b。
[0014]本发明所述的csu-miR_9b在制备二化螟灭虫试剂中的应用。
[0015] -种二化螟灭虫方法，用所述的csu-miR_9b的溶液在二化螟幼虫的上背部或侧 面进行注射或使用所述的csu-miR-9b喂食二化螟。
[0016] 所述的灭虫方法，优选包含以下步骤：
[0017] (1)用无核酸酶水稀释权利要求1所述的csu-miR_9b至浓度为200pmol/μL;
[0018] (2)选取合适天数的二化螟幼虫，在上背部或侧面，使用微量注射器注射0. 5μL/ 头csu_miR-9b溶液；
[0019] (3)用针头挑起虫体，等待一段时间，待csu-miR_9b已混入幼虫血腔，轻轻拔出针 头。
[0020] 有益效果：
[0021] 本发明利用完整的miRNA生物信息学分析，从海量的小RNA文库数据中搜寻到一 条有效miRNA--csu-miR_9b。利用体外合成的csu-miR_9b注射二化螟，对二化螟具有明 显的致死效果，说明该miRNA基因可作为二化螟重要基因的有效干扰物。
[0022] 本发明合成的csu-miR_9b能有效抑制二化螟体内重要基因的表达，更好地抵抗 RNA酶的降解，同时合成成本较低，便于大量实验使用。
【附图说明】
[0023] 图1csu-miR_9b注射实验致死率统计图。
【具体实施方式】
[0024] 实施例1
[0025] (1)化学合成二化螟致死基因csu-miR-9b，序列为5'-UCUUUGGUUAUCUAGCUGUAUG A-3' ；
[0026] (2)使用高效液相色谱法（HPLC)进行纯化；
[0027] (3)使用分光光度计精确定量，冻干保存。
[0028] 实施例2
[0029] -种二化螟的致死基因csu-miR_9b注射方法，包含如下步骤：
[0030] (1)用无核酸酶水稀释权利要求1所述的csu-miR-9b至浓度为200pmol/μL;
[0031] (2)选取合适天数的二化螟幼虫，在上背部或侧面，使用微量注射器注射0. 5μL/ 头csu_miR-9b溶液；
[0032] (3)用针头挑起虫体，等待一段时间，待csu-miR_9b已混入幼虫血腔，轻轻拔出针 头；
[0033] (4)将注射后的幼虫放置在12孔板中，加入适量水稻苗，盖上盖子，用橡皮筋捆 好，每隔6小时观察表型，结果如图1所示，可见csu-miR-9b注射二化螟，对二化螟具有明 显的致死效果，说明该miRNA基因可作为二化螟重要基因的有效干扰物。
【主权项】
1. 二化螟致死基因Csu-miR-9b，其特征在于序列为5 ' -UCUUUGGUUAUCUAGCUGUAU GA-3'。2. 权利要求1所述的csu-miR-9b在制备二化螟灭虫试剂中的应用。3. -种二化螟灭虫方法，其特征在于用权利要求1所述的csu-miR-9b的溶液在二化螟 幼虫的上背部或侧面进行注射或使用权利要求1所述的csu-miR-9b喂食二化螟。4. 根据权利要求3所述的灭虫方法，其特征在于包含以下步骤： (1) 用无核酸酶水稀释权利要求1所述的csu-miR-9b至浓度为200pmol/iiL ; (2) 选取合适天数的二化螟幼虫，在上背部或侧面，使用微量注射器注射0. 5 y L/头 csu_miR-9b 溶液； (3) 用针头挑起虫体，等待一段时间，待csu-miR-%已混入幼虫血腔，轻轻拔出针头。
【专利摘要】本发明公开了二化螟致死基因csu-miR-9b及其应用。二化螟致死基因csu-miR-9b，序列为5’-UCUUUGGUUAUCUAGCUGUAUGA-3’。本发明所述的csu-miR-9b在制备二化螟灭虫试剂中的应用。本发明利用完整的miRNA生物信息学分析，为从海量的小RNA文库数据中搜寻到一条有效miRNA——csu-miR-9b。利用体外合成的csu-miR-9b注射二化螟，对二化螟具有明显的致死效果，说明该miRNA基因可作为二化螟重要基因的有效干扰物。
【IPC分类】A01P7/04, A01N57/16, C12N15/113
【公开号】CN105238786
【申请号】CN201510674017
【发明人】李飞, 葛畅, 王书平, 肖花美, 孙杨
【申请人】南京农业大学
【公开日】2016年1月13日
【申请日】2015年10月16日