专利名称：反义表达水稻OsPDCD5基因在改良水稻产量性状方面的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于转基因技术领域，具体涉及一种改良水稻产量性状方法。
背景技术：
水稻是世界上重要的粮食作物之一，全世界有约2/3的人口以水稻为主食。为了满足日益增长的人口对粮食的需求，提高水稻生产力具有重要意义。产量性状是描述水稻生产力的重要农艺性状，主要由有效穗数、每穗谷粒数和千粒重几部分组成。这些产量性状都属于数量性状WTL)，由许多效应不同的基因所控制。目前国内外利用转基因改良农作物经济性状的技术主要是根据已知的功能基因与表型性状的关系，采用组成型表达载体或组织专一性表达载体将目的基因导入目标植物，以期获得作物特定经济性状或抗逆性性状的改良。程序性细胞死亡(P⑶)是一种自身调控的主动死亡形式，是多细胞生物正常生命活动的一部分，是植物发育过程中及环境胁迫情况下自身启动的重要程序。《s/^O^基因是水稻中的一个程序性细胞死亡基因。0sPDCD5在成熟组织中的表达水平明显高于幼嫩组织，且0sPDCD5的过表达会导致转基因再生植株的死亡。叶片是水稻最重要的器官，有研究表明水稻抽穗后灌浆所需营养物质的60%_80% 来自叶片的光合作用。水稻叶片在结实期间衰老的快慢直接影响水稻的产量，有研究则表明叶片每推迟衰老一天，产量可提高1%左右。叶片衰老最明显的表现就是叶绿素逐渐消失，并出现黄化脱落现象，叶片的衰老程度越严重，叶绿素的含量就越低。然而，植物中存在着一种“持绿”现象，持绿是指叶片在植物生长后期的较长时间内仍保持绿色的一种表型特征。水稻转基因研究表明将抗衰老基因导入水稻能够延缓叶片衰老从而使产量得以提高。叶片衰老过程中有一些基因受到抑制而低水平表达，甚至完全不表达；而另一些基因则被激活，从而增强表达。前一类基因被称为衰老下调基因(senescence down-regulation genes, SDk)，如编码与光合过程有关的蛋白质的转录本丰度随叶片的衰老而急剧下降； 后一类则被称为衰老相关基因(senescence-associated genes, SAGs)。SAGs又可分为两类一类仅在衰老阶段才表达，被称为衰老特定基因(senescence-specific genes, SSk)，如SAG12、SAG13 ；另一类在叶片生长初期就可检测到有低水平表达，在衰老开始后表达量迅速上升。
发明内容
本发明的目的在于提出水稻中反义表达水稻fls/^O^基因在改良水稻产量性状方面的应用。本发明利用反义表达水稻程序性死亡基因fls/^O^及其同源基因的载体转化水稻的籼稻亚种，用以改良水稻的产量性状；
实施例中，本发明将反义表达水稻《s/^O^基因的载体转化籼稻品种金23B，使籼稻金23B的产量性状发生明显改善。即采用籼稻金23B为转基因受体，构建fls/^O^基因的反义表达转基因植株。本发明还提供一种fls/^O^基因反义表达载体，该载体采用pCAMBIA1304为表达载体，将籼稻品种珍汕97的fls/^O^基因反向插入到pCAMBIA1304载体35S组成型启动子下游而获得。本发明还利用反义表达水稻程序性死亡基因《s/^O^及其同源基因的载体转化包括玉米，小麦，高粱和其它谷类作物，用于产量性状的改良。本发明还利用反义表达水稻程序性死亡基因《s/^O^及其同源基因的载体转化双子叶作物，用于产量性状的改良。所述产量性状的改良，包括增加分枝数、籽粒和果实数，提高籽粒和果实体积与重量。本发明还包括水稻程序性死亡基因0sPDCD5的分离、克隆与转基因功能研究等。1) 0sPDCD5基因与蛋白结构组成
采用SSH技术，从分化的水稻愈伤组织中分离与克隆到一段与人类细胞程序性死亡基因TFAR19相关的EST。在此基础上，根据已发表登录的国际数据库中的EST及水稻基因组数据，设计PCR引物，从水稻籼稻品种珍汕97幼苗中克隆到了 TFAR19同源基因的全长cDNA， 命名为0sPDCD5。此外在水稻幼苗组织中还分离到6(5/ ^基因两个可变剪接的cDNA。这三个cDNA已经登录到国际数据库NCBI，登录号分别为AY327105，AY749431和AY749431。 6(5/ ^基因的全长cDNA由7个外显子组成。正常编码的cDNA长416 bp，序列如SEQ. ID N01.所示，编码1 个氨基酸，序列如SEQ. ID N02.所示。该基因的结构与其编码的蛋白质组成如下
水稻fls/^O^基因结构见
图1所示，蛋白结构见图2所示。2)反义表达0sPDCD5基因的表达载体的构建
大多数基因工程都是将基因的核苷酸编码序列正向插入载体，而本发明是将《s/^O^ 反向插入载体。本发明实施例中使用的《s/^O^反向序列如SEQ. ID N03.所示。采用 pCAMBIA1304 ( Center for the Application of Molecular Biology of International Agriculture, Canberra, ACT, Australia )为表达载体，利用酶切位点勒·/ II和分e I将0sPDCD5反向序列插入到pCAMBIA1304载体35S组成型启动子下游，得到反义表达 0sPDCD5的表达载体。其结构图如图3所示。3) 0sPDCD5反向序列基因转化实验
采用金2 为转基因受体，构建反义表达《s/^O^基因的转基因植株。将金2 成熟种子去壳消毒后接种在脱分化植物组织培育基上诱导愈伤组织。在愈伤组织诱导2-3周后， 采用基因枪微弹轰击法，将含0sPDCD5反向序列的经纯化的pCAMBIA1304质粒DNA导入金 23B愈伤组织细胞。在添加30ppm潮霉素的MS培养基上连续培养3_4周筛选抗性细胞系， 然后将筛选的细胞系转移到分化培养基诱导长芽和生根。4)转化处理试管苗移栽及转化植株后代的分子检测
、将0sPDCD5反向序列转化处理的金2 试管苗移栽田间，并采用PCR扩增技术检测候选的抗性植株，于2008年夏获得阳性TO代植株。2008年冬，在海南岛加代繁殖，获得转基因Tl代，共计5个株系。
5) 0sPDCD5反向序列转金2!3B植株的实时定量PCR (RealTime PCR)检测基因0sPDCD5检2 转基因植株中的表达量比野生型植株降低。见图4所示。6) 0sPDCD5反向序列转基因T2代群体产量性状的调查与统计
将0sPDCD5反向序列转基因T2代于2009年春播种，四叶期将3个转基因T2代株系种植在复旦大学试验田，每个株系各种植20株，行株距为6寸χ 6寸，重复三次，同时设立籼稻金2 亲本对照。在成熟期统计各株系20个单株的有效穗数，主穗穗长，主穗一次枝梗及二次枝梗数，主穗总粒数和千粒重，计算平均值，统计结果如下
权利要求
1.水稻《s/^O^基因及其同源基因在改良水稻产量性状方面的应用，其特征在于利用反义表达水稻程序性死亡基因《s/^O^及其同源基因的载体转化水稻的籼稻亚种，以改良水稻的产量性状。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于采用籼稻金23B为转基因受体，构建 0sPDCD5基因的反义表达转基因植株。
3.一种fls/^O^基因反义表达载体，其特征在于采用pCAMBIA1304为表达载体，将籼稻品种珍汕97的fls/^O^基因反向插入到pCAMBIA1304载体35S组成型启动子下游而获得。
4.水稻基因《s/^O^及其同源基因的载体在转化包括玉米，小麦，高粱和其它谷类作物，改良其产量性状方面的应用。
5.水稻基因《s/^O^及其同源基因的载体在转化双子叶作物，改良其产量性状方面的应用。
全文摘要
本发明属于转基因技术领域，具体为反义表达水稻OsPDCD5基因在改良水稻产量性状方面的应用。本发明利用反义表达水稻程序性死亡基因OsPDCD5及其同源基因的载体转化水稻的籼稻亚种，用以改良水稻的产量性状；此外，还在玉米，小麦，高粱和其它谷类作物中反义表达水稻程序性死亡基因OsPDCD5及其同源基因，用于改良谷类作物的产量性状。进一步还在双子叶作物中反义表达水稻程序性死亡基因OsPDCD5及其同源基因，用于改良双子叶作物产量性状，包括增加分枝数，籽粒和果实数，提高籽粒和果实体积与重量。
文档编号C12N15/82GK102181477SQ20111007516
公开日2011年9月14日 申请日期2011年3月28日 优先权日2011年3月28日
发明者孙凡, 杨金水 申请人:复旦大学