专利名称：一株抗日本血吸虫Sj14-3-3蛋白单克隆抗体及其在免疫诊断中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株抗日本血吸虫Sj 14-3-3蛋白单克隆抗体及其在免疫诊断中的应用，属于寄生虫病免疫诊断技术领域。
背景技术：
在世界上的热带与亚热带地区，有76个国家有血吸虫病流行，有近6亿人口受到血吸虫感染的威胁，每年有2000多万人死于血吸虫病。在中国虽然血吸虫病的防治工作取得了巨大的成就，但全国仍有454个县有血吸虫病流行，有病人近42万(2008年全国流调资料)，血吸虫病依然是危害世界及我国人民身体健康的重要公共卫生问题。建立有效的血吸虫病诊断方法，对血吸虫病人、家畜及中间宿主做出准确的诊断，并及时进行治疗，对消灭血吸虫病传染源，控制血吸虫病的流行具有重要的意义。常用的血吸虫病诊断方法有多种
病原学检测
采用显微镜检测病人粪便中是否有血吸虫的虫卵，或采用孵化法检测病人粪便是否能孵化出血吸虫的毛蚴来判断患者是否感染了血吸虫。该方法是血吸虫病诊断的金标准。缺点是虫卵进入粪便的时间与部位是不均一的，极易造成漏检，假阴性率高。此外，虫卵的产生要在血吸虫感染后3-4周，没有早期诊断的价值；以粪便为检测对象，方法难以为检测人员所接受。DNA 检测
DNA是生命体的重要组成成分，是生命体存在的重要证据。检测到血吸虫特异性DNA分子表明宿主体内存在血吸虫活动性感染，具有重要的诊断价值。目前已经建立的血吸虫病 DNA检测诊断方法包括聚合酶链反应方法(PCR)及环介导温DNA扩增方法(LAMP)等。PCR 方法由于操作复杂，需要特殊的仪器设备，在基层血吸虫病防治单位难以开展。LAMP法由于操作间单，敏感性高，容易被基层血吸虫病防治人员所掌握，缺点是容易污染，假阳性高，需要进一步改进操作过程，建立标准的操作规范，才能满足现场应用的需要。免疫学诊断
血吸虫感染宿主后在宿主体内进行生长发育，其排泄分泌物(抗原)进入宿主体内，刺激宿主免疫系统产生特异性免疫反应，产生特异性的抗体。通过免疫学方法检测宿主体内血吸虫特异性抗原或抗体同样具有血吸虫病诊断价值。抗体在血吸虫感染发生后1-2周即出现，并且持续存在于患者体内。对于血吸虫初次感染者，检测抗体具有诊断与早期诊断的价值；对于有继往感染史者，检测抗体则确诊价值不足，但抗体水平的变化对诊断有一定的参考意义。已经建立的检测血吸虫特异性抗体检测方法有很多。包括酶联免疫吸附法(ELISA)、免疫层析法(试纸条法)、免疫渗滤法、 间接血凝法(IHA)、环卵沉淀法(C0PT)、免疫磁珠法、免疫印渍法等，这些方法均已在血吸虫感染筛查中获得应用。它们的共同缺点是检测结果的特异性受到所用抗原纯度及抗原本
3身的特异性所影响，对有继往感染史者没有确诊价值。存在于宿主血液中的血吸虫特异性抗原是指从血吸虫虫体上脱落或分泌到宿主血液中的蛋白、脂类或糖类成份，这类成份随虫体存在而存在，随虫体消失而消失，是宿主体内存在血吸虫活动性感染的直接证据。检测这类成份或其抗原表位能对血吸虫活动性感染进行确诊，并具有疗效考核价值。检测循环抗原的关键是要制备特异性的单克隆抗体，并建立相应的敏感而特异的检测方法。针对血吸虫的各类循环抗原，国内、外分别制备了一些特异性单克隆抗体，常用的检测方法是酶联免疫吸附法(ELISA)。但是，这类方法的一个共同缺点是检测的循环抗原靶标不明确，检测结果的特异性存在问题，此外，常规ELISA的敏感性不足，难以满足现场应用的需要。因此，进一步改进现有的循环抗原检测方法的效能，需要选择明确的检测靶标，制备特异性单克隆抗体，采用更灵敏的检测方法，以提高其特异性与敏感性。
发明内容
本发明提供一种日本血吸虫信号传导蛋白Sjl4-3_3的特异性单克隆抗体，以及检测患者血清中循环抗原Sj 14-3-3蛋白的时间分辩荧光检测方法(TRFIA)，可以进一步提高血吸虫循环抗原检测的特异性与敏感性。本发明的技术方案为达到上述目的，本发明选择日本血吸虫信号传导蛋白 14-3-3分子(Sjl4-3-3)为循环抗原检测的靶标。一种抗重组Sj 14-3-3蛋白的单克隆抗体，由保藏号为CCTCC C201118的杂交瘤细胞JYQ5C6-1产生。产生所述单克隆抗体的重组Sj 14-3-3蛋白的表达，将编码Sj 14-3-3蛋白分子核苷酸片段SEQ ID N0:2插入到一种表达载体pEGX-4T-3编码谷胱甘肽转移酶GST基因的下游，构建重组表达载体Sjl4-3-3/pEGX-4T-3，然后将重组表达载体Sjl4-3-3/pEGX-4T_3转化入一种宿主细胞大肠杆菌BL21 (DE3)中表达一种含有由载体编码的谷胱甘肽转移酶GST 与日本血吸虫Sjl4-3-3蛋白组成的GST- Sj 14-3-3融合蛋白粗制品；
采用Glutathione Sepharose 4B亲和层析法对GST- Sjl4_3_3融合蛋白粗制品进行纯化，获得纯化的GST-Sj 14-3-3融合蛋白；
将纯化的GST-Sjl4-3-3融合蛋白用凝血酶切割，使GST-Sjl4-3-3融合蛋白裂解为GST 和重组Sj 14-3-3蛋白两部分，再用Glutathione Sepharose 4B亲和层析法去除酶切产物中的GST蛋白，从而获得纯化的重组Sj 14-3-3蛋白。所述的重组Sjl4-3_3蛋白的表达，重组Sjl4-3_3蛋白分子的核苷酸序列与SEQ ID NO 2保持有至少90%的同源性。所述的重组Sj 14-3-3蛋白的表达，重组Sj 14-3-3蛋白分子的氨基酸序列与 Sj 14-3-3蛋白分子的氨基酸序列蛋白SEQ ID NO=I保持有至少90%的同源性。所述的抗重组Sjl4-3_3蛋白的单克隆抗体的应用，在血吸虫感染免疫诊断中用于检测血吸虫感染患者或动物血液中循环抗原Sjl4-3-3蛋白所使用的抗体。所述的重组Sjl4-3_3蛋白的制备方法，包括转录，翻译，蛋白分离和纯化，以及鉴定步骤。本发明为了获得纯化的重组Sjl4-3_3蛋白，采用融合蛋白策略，使表达出来的重组Sjl4-3_3蛋白可以通过酶切与亲和层析方法纯化制备。所述重组Sjl4-3_3蛋白应用包括1)用于通过免疫学方法检测血吸虫特异性抗体的抗原，用于血吸虫感染患者的筛查与诊断。包括但不局限于酶联免疫吸附法(ELISA)， 免疫印渍法(I mmunοb 1 ο t)，免疫层析法，免疫渗滤法，放射免疫法，时间分辩荧光法 (TRFIA),免疫磁珠法，等等。2)用于制备抗日本血吸虫病信号传导蛋白Sjl4-3-3的特异性多克隆抗体与单克隆抗体。本发明优选的表达质粒是pEGX-4T-3 (美国GE Healthcare Life Science公司产品)，适合在大肠杆菌工程菌中表达。但是，本发明中的Sj 14-3-3蛋白也可选择利用其它质粒来表达，这些表达质粒包括但是不局限于原核、真核表达系统常用的质粒。具体地，该表达质粒含有适当的启动子，用以控制融合蛋白的表达。这些启动子包括但是不局限于以下所述的tac启动子，优选的启动子为T7。本发明提供重组Sjl4-3_3蛋白的表达质粒的构建方法及工程菌构建方法。首先克隆获得编码Sjl4-3_3蛋白的核苷酸序列。编码Sjl4-3_3蛋白氨基酸序列的核苷酸序列与序列SEQ ID NO :2保持有至少90%的同源性。具体地，通过RT-PCR技术，从血吸虫mRNA中反转录合成编码Sjl4_3_3蛋白核苷酸片段，并使Sjl4-3-3基因片段的5'端带有的酶切位点，3'端带有5^1的酶切位点。将Sjl4-3-3基因片段克隆到TA克隆载体pGEM-T中构建重组质粒Sjl4-3-3/pGEM_T 进行DNA序列分析，确定其基因序列的正确性。然后将Sj 14-3-3基因片段通过及丽71，Sail酶切位点插入到表达质粒pGEX_4T_3 中构建重组表达质粒Sjl4-3-3/pGEX-4T-3。将该重组表达质粒转化到大肠杆菌DH5 α，再转种到含有氨苄青霉素(AMP)的LB平板(1%的蛋白胨，0. 5%的酵母抽提物，1%氯化钠，琼脂粉1. 2%，氨苄青霉素100μ g/mL)上进行繁殖和保种。本发明表达重组Sjl4-3-3蛋白的重组质粒Sjl4-3-3/pGEX-4T-3可在多种大肠杆菌中表达，其优选的菌株是大肠杆菌BL21 (DE3)。本发明提供一种工程菌大规模表达GST-Sjl4-3_3融合蛋白的方法。具体地，将含有重组表达质粒Sjl4-3-3/pGEX-4T-3的单个菌落接种到选择性培养基LB (1%的蛋白胨， 0.5%的酵母抽提物，1%氯化钠，氨卞青霉素100 μ g/mL)中，37°C振摇过夜。第二天按1 10稀释接种到新鲜的LB培养基中，37°C振摇培养4h (OD600 0. 4)，加入lmmol/L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达GST-Sj 14-3-3融合蛋白。GST-Sj 14-3-3融合蛋白的表达，可以通过一般的蛋白生化手段检测，包括但不局限于SDS-PAGE，Western blotting 等。本发明也提供一种GST-Sjl4-3_3融合蛋白的分离纯化方法。具体地，将含有GST-Sjl4-3_3融合蛋白的表达产物与Glutathione Sepharose 4B胶混合，使Glutathione Sepharose 4B捕获表达产物中的GST-Sj 14-3-3，再用还原型谷胱甘肽溶液洗脱结合在胶上的GST-Sjl4-3-3融合蛋白。GST-Sjl4-3-3融合蛋白的纯度可以达95%以上。本发明还提供一种重组Sjl4-3_3蛋白的纯化方法。具体地，将纯化的GST-Sjl4-3_3融合蛋白用凝血酶(Thrombin)切割，使融合蛋白裂解为GST和重组Sj 14-3-3蛋白两部分，再用Glutathione Sepharose 4B亲和层析法去
5除酶切产物中的GST蛋白，从而获得纯化的重组Sj 14-3-3蛋白。本发明提供一种制备抗重组Sjl4-3_3蛋白特异性单克隆抗体的方法。具体地，以纯化的重组Sjl4-3_3蛋白与福氏佐剂混合，免疫BALB/c小鼠，连续加强免疫2次后，通过酶联免疫吸咐法测定小鼠血清中是否有抗重组Sjl4-3-3蛋白特异性抗体产生。然后取免疫小鼠的脾脏细胞与同系小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)进行杂交融合，通过一系列的筛选，制备能产生抗重组Sjl4-3-3蛋白的特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞。将杂交瘤细胞进行大量培养，收集上清液，或将杂交瘤细胞种植到同系小鼠腹腔形成实体瘤制备含单克隆抗体的腹水。用金黄色葡萄球菌A蛋白亲和层析胶经亲和层析法制备纯化的抗重组Sjl4-3-3蛋白单克隆抗体。本发明还提供一种抗重组Sjl4-3_3蛋白单克隆抗体特异性的鉴定方法。具体地，将重组Sjl4-3_3蛋白，健康人血清，血吸虫成虫，排泄分泌抗原，可溶性虫卵抗原，肝吸虫抗原，疟原虫抗原，大肠杆菌抗原进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后采用电转移方法将蛋白条带转移到硝酸纤维素(NC)膜上，将含有各抗原蛋白条带的NC膜与抗重组Sjl4-3-3蛋白单克隆抗体反应，加入酶标记抗鼠IgG 二抗后，用底物3，3-二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB)显色，观察单克隆抗体与各抗原的反应情况，以判断此单克隆抗体的特异性。本发明提供的抗重组Sjl4-3_3蛋白单克隆抗体可用于检测血吸虫感染者血液中循环抗原Sjl4-3-3蛋白。检测方法分直接法和间接法两类，包括但不局限于斑点法、酶联免疫吸附法、免疫印渍法(Immunoblot)，免疫层析法，免疫渗滤法，放射免疫法，时间分辩荧光法(TRFIA)，免疫磁珠法，等等。本发明提供一种检测日本血吸虫信号传导蛋白Sjl4-3_3分子的时间荧光分辩方法。具体地，以稀有元素铕标记抗Sjl4-3_3蛋白单克隆抗体为检测抗体，以抗 Sjl4-3_3蛋白的多克隆抗体或单克隆抗体为捕获抗体包被酶标板，与待检者血清进行反应后加入铕标记抗Sjl4-3_3蛋白单克隆抗体进行检测，通过时间荧光分辩分析仪检测以判定被检测血清样本中是否含有Sjl4-3-3蛋白分子。本发明的有益效果日本血吸虫信号传导蛋白Sjl4-3_3分子是血吸虫排泄分泌物中的一个高丰度循环抗原，检测病人体内血吸虫特异性的Sjl4-3-3蛋白分子对血吸虫活动性感染具有确诊价值。本发明制备的抗Sjl4-3-3蛋白分子特异性单克隆抗体可以用于建立各种检测抗Sjl4-3-3蛋白循环抗原的免疫学诊断方法。以抗Sjl4-3-3蛋白特异性单克隆抗体建立的检测循环抗原Sjl4-3-3蛋白的时间荧光分辩方法可以进一步提高检测血吸虫循环抗原Sjl4-3-3蛋白的准确性和阳性率，有良好的应用前景，对控制血吸虫病流行有重要的意义。生物材料样品保藏
一种抗重组Sjl4-3-3蛋白的单克隆抗体，由杂交瘤细胞JYQ5C6-1产生，杂交瘤细胞JYQ5C6-1已保藏在中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏编号为CCTCC C 201118，保藏日期为2011年3月23日。
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图1日本血吸虫信号蛋白Sj 14-3-3基因扩增
1、DNA分子量标志物；2、RT-PCR扩增产物。图2重组表达质粒构建结果
1、重组表达质粒Sjl4-3-3/pGEX-4T-3
2、表达质粒pGEX-4T-3
3、IkbDNA分子量标志物
图3重组质粒Sjl4-3-3/pGEX-4T-3酶切分析结果 Ulkb DNA分子量标志物
2、未被酶切的重组表达质粒Sj 14-3-3/pGEX-4T-3
>J^BamHY—SalY 双酶切的 Sjl4-3_3/pGEX-4T_3 质粒 DNA 产物
图4重组日本血吸虫信号转导蛋白Sj 14-3-3融合表达
1、蛋白质分子量标志物；
1、E. coli BL21 对照；
3-5、含重组质粒转化子细菌表达产物
图5亲和层析纯化重组日本血吸虫信号转导蛋白Sj 14-3-3
1、蛋白质分子量标志物；
2、纯化的重组日本血吸虫信号转导蛋白Sjl4-3-3
图6抗重组Sjl4-3-3蛋白单克隆抗体的特异性分析
1、重组Sj14-3-3蛋白；
2、可溶性虫卵抗原；
3、成虫排泄分泌抗原；
4、成虫抗原；
5、蛋白分子量标志物；
6、大肠杆菌蛋白；
7、健康人血清；
8、华支睾吸虫可溶性蛋白；
图7 TRFIA与ELISA两种方法检测Sjl4_3_3蛋白效能的比较
TRFIA时间分辩荧光法，敏感性为0.78 ng/mL，检测线性范围为0. 78-800ng/mL
ELISA酶联免疫吸附法，敏感性为6. 25 ng/mL，检测线性范围为6. 25-200ng/mL。
具体实施例方式下面提供的实施例可以详细地解释本发明的主要内容，但不局限于以下这些内容。实施例1 日本血吸虫信号转导蛋白Sj 14-3-3基因克隆
日本血吸虫信号转导蛋白Sj 14-3-3基因通过RT-PCR技术，从血吸虫成虫组织的mRNA 中反转录合成而来，具体制备方法如下 1、血吸虫成虫mRNA的制备
取新鲜分离的血吸虫成虫0.5g，在液氮中冷冻后，在陶瓷研钵中粉碎，再用GE Healthcare 公司的 mRNA 纯化试剂盒(Illustra QuickPrep mRNA purification kit)制备纯化mRNA，操作方法严格按试剂盒的操作说明书。用紫外分光光度计测mRNA的纯度与含量。2、Sj 14-3-3 基因扩增 2.1引物设计
Sj 14-3-3 1: ttggatccatgagggattcgttcgt,(划线处为及拙/71 酶切位点), Sj 14-3-3 2: ttgtcgactcagccatcatttccgt,(划线处为酶切位点), 2. 2第一链cDNA合成
采用Phusion RT-PCR Kit (购自NEB北京分公司)·在一 0. 2mL的PCR管中，加入 mRNA 2 μ L (约 IOng), 10 mM dNTP 混合物 1 μ L，Oligo (dT) primer 1 μ L，加无离子水至10 UL0混勻，离心收集于管底。65° C水浴预变性5min，置冰上冷却。加入IOX反转录缓冲液2 UL,反转录酶混合物2 μ L，无核糖核酸酶水(无Rnase水)6 μ L。混勻，离心收集于管底。25° C保温lOmin，再在40° C保温30min以合成cDNA。80° C保温5min以中止反应。2.3目的基因扩增
在一个 0. 2mL 的 PCR管中，加入 2XPhusionK Master Mix 25μ ，第一链 cDNA 3μ ，引物 Sj 14-3-3 1 :0. 5μ (25μΜ)，Sjl4_3_3 2 0. 5μ (25μΜ)，加无核糖核酸酶水到终体积50μ 。 PCR 条件98 "C 30 Sec ；然后 98°C变性 10 Sec ；65°C 30 Sec, 72°C 50 Sec，一共 30 个循环；最后，72°C保温5min。采用低融点琼脂糖凝胶电泳方法回收纯的Sjl4_3_3基因片段。 具体是用1%的低融点agarose胶电泳PCR扩增产物，切下分子量约750bp左右的目的DNA 条带，再用Promega公司的PCR产物回收试剂盒纯化Sj 14-3-3基因DNA片段。如图1所示。TA克隆与序列分析
Sjl4-3-3的3'端加腺嘌呤(A)尾巴将纯化的Sjl4-3-3片段置于PCR反应管中， 加入 IOX Taq DNA 聚合酶链反应缓冲液 ΙΟμ ，MgCl2 ΙΟμ (25 mmol/L), dATP μ (10 mmol/L), Taq DNA聚合酶 μ (5 U/^L)，加灭菌无离子水至100μ ，在PCR仪上72 ！保温30 min，使Sjl4-3-3基因片段的3'端加上“A”尾巴。用Promega公司的酶切产物纯化试剂盒纯化加A尾后的Sjl4-3-3基因DNA片段。将Sjl4_3_3 DNA片段与TA clone载体 pGEM-T(美国PR0MEGA公司产品)按照3 1的比例混合，在T4 DNA连接酶的作用下连接，反应体系如下2X ligase buffer 5 μ L，pGEM-T vector Ιμ (50ng), Sj 14-3-3 DNA 片段3PL，T4 DNA ligase 1PL(1U)，总体积10μ 。混勻后，短暂离心，16°C水浴连接过夜， 形成重组质粒Sjl4-3-3/pGEM-T。电转化1)取5μ 连接产物加入到50μ 感受态细胞Ε. coli DH5 α中，小心混勻， 勿使有气泡产生，放置冰浴上30 min。2)将连接产物与E.coli DH5 α的混合物转移到冰上预冷的狭缝为0.1cm的电击杯中，勿使有气泡产生，小心拭去电击杯外的冷凝水。3)设置电脉冲仪(BIO-RAD)脉冲参数电压2. 5 kV，电容25 PF，电阻200 Ω。将电击杯插入电脉冲仪电击槽内，同时按住两个脉冲电极保持至放电为止。4)取出电击杯，加入0.5 mL 37 0C 预热的SOC培养基，混勻后将电击后的菌液转移到一无菌玻璃试管中，37 200 rpm振荡培养40 min。5)取200μ 菌液均勻涂布于表面预先涂有40μ X-gal (40 mg/mL)的LB 平板上(含Amp 10(^g/mL)。室温下放置待平板上的菌液完全吸收后，倒置平板于37 ！培养箱过夜。在LB平板上出现的白色菌落可初步判定为阳性克隆，蓝色菌落为阴性克隆。将白色菌落细菌送到上海英俊公司进行DNA序列分析。实施例2 重组Sj 14-3-3蛋白表达质粒的构建
本发明采用PGEX-4T-3为表达载体质粒，其制备方法为常用分子生物学方法。即通过培养含有表达载体的菌种，提取获得该质粒。制备质粒后-20°C保存待用。具体如下，对表达载体质粒pGEX-4T-3及重组质粒Sjl4-3-3/pGEM_T分别进行 BamHl, fe/l 双酶切。具体条件如下。质粒(pGEX_4T_3 或Sjl4-3_3/pGEM_T)DNA ΙΟμ ,ΝοοΙ \VL,Xho\ μ , IOX酶切缓冲液5μ ;ddH20 33μ ，总体积为50μ 。37°C恒温水浴锅内温浴 3小时，通过低琼脂糖凝胶电泳回收线性化的PGEX-4T-3质粒DNA和Sjl4_3_3 DNA片段。 将回收的Sjl4-3-3 DNA片段与表达质粒pGEX-4T-3 DNA片段连接，构建融合蛋白表达质粒 Sjl4-3-3/pGEX-4T-3。连接体系为10uL，双酶切的pGEX_4T_3质粒与双酶切Sjl4_3_3 DNA 的摩尔比为 1 2-10，10XT4 DNA Iigase 缓冲液 μ ，Τ4 DNA Iigase Ιμ ,加无菌水至总体积为ΙΟμ 。连接反应16°C恒温水浴内温浴16小时。连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞。阳性克隆的鉴定是通过含Ampicilin的LB平板挑选阳性克隆，抽提质粒，并通过双酶切分析确定目的基因是否被插入到表达载体中(图2，3所示)。实施例3 重组Sj 14-3-3蛋白表达工程菌的构建具体方法如下。首先挑选含有Sjl4-3-3/pGEX-4T-3重组质粒的细菌克隆，提取质粒DNA。然后，用电转化的方法把质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中。质粒DNA提取方法按Promega公司质粒DNA纯化试剂盒操作说明进行。电转化方法转化大肠杆菌具体如下。先进行感受态细胞的准备。挑取新鲜的BL21(DE3)单菌落，接种至含有3mL LB液体培养基的试管中，37°C、200r/min培养过夜。然后取ImL的培养物接种至含有500mL新鲜 LB培养基的2L三角摇瓶中，37°C、250-300r/min培养过夜，至OD6tltl小于0. 4，将细菌培养物置于冰上冷却，2500g离心20min，去上清，用500mL的冰预冷的ddH20将菌体沉淀重悬。离心后，再用250mL的冰预冷的10%的甘油溶液将菌体沉淀重悬。再离心，用IOmL的冰预冷的10%的甘油溶液将菌体沉淀重悬。再离心，用冰预冷的10%的甘油溶液将菌体沉淀重悬， 调节菌液OD6tltlnm=IO. 0。以每管IOOPL的体积分装感受态细胞，_70°C保存备用。电击转化，具体如下。将Sj 14-3-3/pGEX-4T-3重组质粒DNA溶解在5 ΙΟμ TE溶液中，与80μ 的上述感受态菌体混勻，转至0. Icm狭缝的预冷电转化杯中，冰浴30min。然用1. 8kv电压、25PF电容；200 Ω电阻的条件进行电击。电击完毕后，加入ImL 37°C预温的LB液体培养基悬浮， 并转至无菌的玻璃试管中，37°C、250-300r/min培养40min。将菌液涂布到含有Ampicilin 的LB平板上，置于37 °C培养过夜。实施例4 =GST-Sj 14-3-3融合蛋白表达和纯化重组GST-Sj 14-3-3融合蛋白的表达
将表达菌株接种于50mL LB液体培养基中(AMP，100 μ g/mL)，37°C >200 rpm过夜培养。 取IOmL过夜培养菌液，按照1 100分别转种于1，000 mL LB肉汤培养基中(AMP，IOOyg/ mL)中，37 200 rpm振荡培养，培养3 4 h至菌液光密度OD6tltl M约为0. 5。加入IPTG 至终浓度为1 mmol/L，继续培养4 h。4°C、5，000 rpm离心10 min，收集所有细菌。取少量的细菌进行SDS-PAG电泳，观察目的蛋白的表达情况。如图4所示。用100 mL PBS重悬浮细菌沉淀。-30 ！反复冻融2 — 3次，冰浴中超声破碎细菌7次(功率200W)，每次20 sec, 间隔20 sec.裂解液以14，000Xg、4 °C离心10 min，收集上清液。按GST融合蛋白纯化试剂盒(购自Pharmacia公司)说明书准备50%的 Glutathione Sepharose 4B胶，每100 mL上清中加入2 mL胶，充分混勻，室温结合60 min, 500 Xg离心10 min,收集沉淀，用PBS洗涤数次，去除未结合的蛋白质。用1 mL PBS悬浮凝胶，加入还原型谷胱甘肽溶液(50 mol/L Tris、pH 8.0,10 mol/L谷胱甘肽) 2 mL，室温下作用10 min，洗脱结合在凝胶上的GST-Sjl4-3-3融合蛋白。重复洗脱3次，收集合并全部洗脱液。实施例5 重组Sj 14-3-3蛋白的纯化
在含GST-Sj 14-3-3融合蛋白的溶液中，加入40 U的凝血酶，混勻后，22°C水浴消化12 h。将酶解产物重复过Glutathione Sepharose 4B胶柱(2 mL床体积)以吸附其中的GST蛋白，将过柱液进行SDS-PAGE检测，直至溶液中的GST蛋白全部消除，制备纯化的重组Sjl4-3-3。如图5所示。实施例6 抗重组Sj 14-3-3蛋白单克隆抗体的制备
取8周龄SPF级雌性BALB/c小鼠3只，首次免疫用完全福氏佐剂加纯化的重组 Sjl4-3-3蛋白为抗原免疫，剂量为100 Pg/只，其后每隔2周用相同剂量的不完全佐剂加抗原进行加强免疫，连续加强免疫3次。当小鼠血清抗体效价>1:10，000时，取免疫小鼠的脾细胞与对数生长期的SP2/0细胞(骨髓瘤细胞)在50%PEG4000的作用下进行细胞融合，用 HAT选择培养基对融合细胞进行筛选。采用间接ELISA法对有杂交瘤细胞生长的细胞孔上清液进行检测，对上清液能识别重组Sjl4-3-3蛋白的且反应较强的杂交瘤细胞采用有限稀释法进行多次克隆化，直至每个单克隆细胞孔上清液检测均为阳性，建立杂交瘤细胞株。将杂交瘤细胞进行大量培养，收集上清液，或将杂交瘤细胞种植到同系小鼠腹腔形成实体瘤，收集含单克隆抗体的腹水。用金黄色葡萄球菌A蛋白亲和层析胶经亲和层析法制备纯化的抗重组Sjl4-3-3蛋白单克隆抗体。按照抗体类型及亚类鉴定试剂盒操作说明书的要求，采用间接ELISA法对单抗进行分型鉴定。结果获得一株产特异性高亲和力的单克隆抗体的杂交瘤细胞JYQ5C6-1，属 IgGl亚类。亲和常数为8. 82X 108 L/M0L。实施例7 单克隆抗体JYQ5C6-1特异性分析
将将重组Sjl4-3-3蛋白，健康人血清，血吸虫成虫，排泄分泌抗原，可溶性虫卵抗原， 肝吸虫抗原，疟原虫抗原，大肠杆菌抗原进行12% SDS-PAGE，电泳结束后立即用半干转印缓冲液(Tris 5. 82g, glycine 2. 93g,methanol 200mL，加无离子水至 1L)平衡胶 15 min。准备预先切割好的厚滤纸和硝酸纤维素膜(切割至与电泳凝胶大小一致)，使用前放置于半干转印缓冲液中浸泡15-30 min。将转膜装置的各组件从下至上依次按阳极、滤纸、NC膜、凝胶、滤纸、阴极的顺序放好，滤纸、NC膜、凝胶精确对齐，每一步都要去除气泡。在室温，恒电压20V条件下电转化30min。硝酸纤维素(NC)膜用5%脱脂牛奶PBST (PBS含0. 05%Tween-20) 封闭，室温1 h或4°C过夜；将NC膜纵切成0.3cm宽的长条，编上号码，在水化盘槽内分别与单克隆抗体JYQ5C6-1进行反应，室温摇床上反应1 h。用TBST洗涤NC膜条3次，每次 lOmin，加入用PBS作1:10000稀释的HRP标记抗鼠IgG，室温反应1 h。再用TBST洗涤3
10次后用3，3- 二氨基联苯胺钠盐(DAB)底物液(6mg DAB溶于IOmL PBS中，用前加10 μ L H2O2)显色2 min，用蒸馏水漂洗NC膜条终止反应，观察结果。结果显示单克隆抗体JYQ5C6-1 可与重组Sjl4-3-3蛋白、血吸虫可溶性虫卵抗原、成虫排泄分泌抗原及成虫抗原中的天然 Sj 14-3-3蛋白结合，但不与大肠杆菌蛋白、健康人血清、华支睾吸虫可溶性蛋白反应，显示出良好的特异性。如图6所示。实施例8单克隆抗体JYQ5C6-1时间分辩荧光法检测Sjl4_3_3蛋白
以单克隆抗体JYQ5C6-1包被酶标板，与不同浓度的重组Sjl4-3-3蛋白抗原反应后，再用稀土元素铕标记的单克隆抗体JYQ5C6-1反应，在时间荧光分辩仪上检测，以建立检测循环抗原Sjl4-3-3蛋白的时间分辩荧光方法(TRFIA)。同时以酶联免疫吸附方法(ELISA)为对照。时间荧光分辩方法的灵敏度为0. 78ng/mL，检测线性范围为0. 78-800ng/mL。如图7 所示。分别用TRFIA和ELISA法检测500条尾蚴感染后0、7、14、21天后的家兔血清中的循环抗原Sjl4-3-3蛋白，TRFIA的阳性率分别为0、30%、70%、100%,而常规的ELISA法检测的阳性率则分别为0，10%, 30%, 60%。TRFIA检测循环抗原Sj 14-3-3的效能明显优于常规的ELISA法。
权利要求
1.一种抗重组Sj 14-3-3蛋白的单克隆抗体，由保藏号为CCTCC C201118的杂交瘤细胞 JYQ5C6-1 产生。
2.产生权利要求1所述单克隆抗体的重组Sjl4-3-3蛋白的表达，其特征在于将编码 Sjl4-3-3蛋白分子核苷酸片段SEQ ID NO :2插入到一种表达载体pEGX_4T_3编码谷胱甘肽转移酶GST基因的下游，构建重组表达载体Sjl4-3-3/pEGX-4T-3，然后将重组表达载体 Sjl4-3-3/pEGX-4T-3转化入一种宿主细胞大肠杆菌BL21(DE3)中表达一种含有由载体编码的谷胱甘肽转移酶GST与日本血吸虫Sj 14-3-3蛋白组成的GST- Sj 14-3-3融合蛋白粗制品；采用Glutathione Sepharose 4B亲和层析法对GST- Sjl4_3_3融合蛋白粗制品进行纯化，获得纯化的GST-Sj 14-3-3融合蛋白；将纯化的GST-Sjl4-3-3融合蛋白用凝血酶切割，使GST-Sjl4-3-3融合蛋白裂解为GST 和重组Sj 14-3-3蛋白两部分，再用Glutathione Sepharose 4B亲和层析法去除酶切产物中的GST蛋白，从而获得纯化的重组Sj 14-3-3蛋白。
3.权利要求2所述的重组Sjl4-3-3蛋白的表达，其特征在于重组Sjl4-3-3蛋白分子的核苷酸序列与SEQ ID NO 2保持有至少90%的同源性。
4.权利要求2所述的重组Sjl4-3-3蛋白的表达，其特征在于重组Sjl4-3-3蛋白分子的氨基酸序列与Sj 14-3-3蛋白分子的氨基酸序列蛋白SEQ ID NO=I保持有至少90%的同源性。
5.权利要求1所述的抗重组Sj14-3-3蛋白的单克隆抗体的应用，其特征在于在血吸虫感染免疫诊断中用于检测血吸虫感染患者或动物血液中循环抗原Sjl4-3-3蛋白所使用的抗体。
全文摘要
一株抗日本血吸虫Sj14-3-3蛋白单克隆抗体及其在免疫诊断中的应用，属于寄生虫病免疫诊断技术领域。本发明提供了一种抗重组Sj14-3-3蛋白的单克隆抗体，由保藏号为CCTCCC201118的杂交瘤细胞JYQ5C6-1产生。所述的抗重组Sj14-3-3蛋白的单克隆抗体的应用，在血吸虫感染免疫诊断中用于检测血吸虫感染患者或动物血液中循环抗原Sj14-3-3蛋白所使用的抗体。本发明制备的抗Sj14-3-3蛋白分子特异性单克隆抗体可以用于建立各种检测抗Sj14-3-3蛋白循环抗原的免疫学诊断方法。以抗Sj14-3-3蛋白特异性单克隆抗体建立的检测循环抗原Sj14-3-3蛋白的时间荧光分辩方法可以进一步提高检测血吸虫循环抗原Sj14-3-3蛋白的准确性和阳性率，有良好的应用前景。
文档编号C12N15/70GK102180968SQ201110075088
公开日2011年9月14日 申请日期2011年3月28日 优先权日2011年3月28日
发明者余传信, 宋丽君, 张伟, 梁幼生, 殷旭仁, 王玠, 钱春艳, 高琪 申请人:江苏省血吸虫病防治研究所