专利名称：草甘膦耐受性甜菜的制作方法
技术领域：
本发明涉及草甘膦耐受性甜菜植株，植物材料和种子。
背景技术：
甜菜(Beta vulgaris)在许多国家中被作为商业农作物而栽种，其总产量超过 240百万公吨。N-(膦酰基甲基)甘氨酸(通常被称为草甘膦(Glyphosat))是一种广谱除草剂， 由于其高效，具有生物可降解性和对动物与人类的低毒性故被广泛使用。草甘膦抑制莽草酸途径，该途径导致包括氨基酸类和维生素类的芳香化合物的合成。具体而言，草甘膦通过抑制酶5-烯醇丙酮酰-3-磷酸基莽草酸合酶(EPSP合酶或EPSPQ，抑制磷酸烯醇丙酮酸和 3-磷酸基莽草酸反应转变为5-烯醇丙酮酰-3-磷酸基莽草酸。当用草甘膦处理常规植物的时候，植物不能产生生长和生存所需的芳香族氨基酸(例如苯丙氨酸和酪氨酸)。EPSPS 存在于所有植物，细菌，和真菌中。它不存在于不能自身合成芳香族氨基酸的动物中。因为芳香族氨基酸的生物合成途径不存在于哺乳动物、禽类或水生生命形式中，故即使草甘膦对这些有机体存在任何毒性，其毒性也是很少量的。EPSPS酶天然地存在于植物和微生物来源的食物中。草甘膦是除草剂(诸如美国Monsanto公司生产的 Roundup )中
的有效成分。典型地，其以水溶性盐诸如铵盐、烷基胺盐、碱金属盐或三甲基锍 (trimethylsulfonium)盐进行配制。最通常的制剂之一是草甘膦的异丙胺盐，其是
Roundup 除草剂中使用的形式。已经证明通过在植物的基因组中插入产生草甘膦耐受性EPSP合酶(例如来自农杆菌属样品(Agrobacterium sp.)菌株CP4AcO的CP4-EPSPS)的能力可以生产草甘膦耐受性植物。通过农杆菌介导的转化，将编码草甘膦耐受性EPSPS (例如CP4-EPSPQ的基因导入植物的基因组中可以生产草甘膦耐受性甜菜植株。WO 99/23232中已经公开了所述甜菜植株，其表达CP4-EPSPS。然而，由采用CP4-EPSPS基因以该方式转化的细胞所生长的甜菜植株，在其性状上存在很大差异，这是由于如下事实，即基因被插入在植物基因组中的随机位置上。特定转基因插入至染色体上特定位置通常被称为“事件(event)”。术语“事件” 也用来区分遗传工程化农作物品种。合乎需要的事件是非常稀少的。由于转基因被插入到具有生长重要性的植物基因中，导致基因断裂和不表达，或转基因插入到不能使转基因表达或使其表达非常低的染色体部分中，因此绝大多数的事件是会被废弃的。因为这个原因， 为了识别特征在于导入基因充分表达的事件，就需要筛选大量的事件。这个过程非常费时而且成本高昂，而且其绝非可以保证能够发现具有满意性质的植株。
发明内容
因此，本发明的目的是提供甜菜植株，其表现出对抗草甘膦的高水平耐受性，但不具有在其他重要农学性质诸如生长、产量、品质、病原抗性等方面上的缺点。根据本发明的草甘膦耐受性甜菜植株的特征在于a)甜菜植株获自保藏于NCIMB，Aberdeen(苏格兰，英国)，保藏号为NCIMB 41158 或NCIMB 41159的种子，和/或b)采用含有SEQ ID NO :1核苷酸序列的第一引物和含有SEQ IDNO 2核苷酸序列的第二引物，使用聚合酶链式反应，可从所述甜菜植株、其部分或其种子的基因组DNA中扩增630-700bp，优选664bp的DNA片段，和/或c)采用含有SEQ ID NO 3核苷酸序列的第一引物和含有SEQ IDNO 4核苷酸序列的第二引物，使用聚合酶链式反应，可从所述甜菜植株、其部分或其种子的基因组DNA中扩增3500-3900bp，优选3706bp的DNA片段，和/或d)采用含有SEQ ID NO 7核苷酸序列的第一引物和含有SEQ IDNO 8核苷酸序列的第二引物，使用聚合酶链式反应，可从所述甜菜植株、其部分或其种子的基因组DNA中扩增270-300bp，优选288bp的DNA片段，和/或e)采用含有SEQ ID NO 9核苷酸序列的第一引物和含有SEQ IDNO 10核苷酸序列的第二引物，使用聚合酶链式反应，可从所述甜菜植株、其部分或其种子的基因组DNA中扩增710-790bp，优选751bp的DNA片段，和/或f)采用含有SEQ ID NO 14核苷酸序列的第一引物和含有SEQ IDNO 16核苷酸序列的第二引物，使用聚合酶链式反应，可从所述甜菜植株的基因组DNA中扩增990-1100bp， 优选1042bp的DNA片段。聚合酶链式反应(PCR)是用于扩增核酸分子的众所周知的标准方法(参见，例如 US 4，683，202)。根据本发明的甜菜植株(以下称为“事件H7-1”)表现出对草甘膦除草剂高度耐受。此外，事件H7-1的生长性状和其他重要农学性质未受转化过程影响。事件H7-1表达高水平的农杆菌-CP4-EPSPS-基因，该基因被稳定地掺入植物基因组中，且其为植物提供草甘膦耐受性。植物通过采用二元载体PV-BVGT08的农杆菌介导的转化技术进行制备。该载体在左和右边界区(“Border”区)之间包含下列序列编码区，其由来自拟南芥EPSPS 的叶绿体转运肽编码序列(称为ctp》组成，该编码序列与CP4-EPSPS编码序列结合，且处于玄参花叶病毒启动子(PFMV)和来自豌豆的E9-3’转录终止序列的调控下。在本发明优选实施方案中，37(^bp、664bpJ8m3p、751bp和1042bp DNA片段分别显示出与 SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :13、SEQ IDNO 11、SEQ ID NO 12 或 SEQ ID NO 17 的核苷酸序列至少95%，优选至少99%，更优选至少99. 9%的同一性。例如，95%同一性意指特定序列95%的核苷酸与对比序列相同。为此目的，序列可采用BLAST程序(例如可获自 http://www. ncbi. nlm. nih. gov/blast/bl2seq/bl2. html)进行排列和对比。最优选地， 3706bp DNA片段含有SEQ ID NO :6的核苷酸序列，664bp DNA片段含有SEQ ID N0:13的核苷酸序列，288bp DNA片段含有SEQ ID NO :11的核苷酸序列，751bp DNA片段含有SEQ IDNO 12的核苷酸序列，和/或1042bp DNA片段含有SEQ IDNO 17的核苷酸序列。本发明还涉及保藏于NCIMB，Aberdeen (苏格兰，英国)，保藏号为NCIMB 41158或 NCIMB 41159的种子。所述种子可被用于获得草甘膦耐受性的甜菜植株。种子可被锯开且成长的植物将具有草甘膦耐受性。本发明还涉及草甘膦耐受性的甜菜植株的细胞、组织或部分。本发明另一方面是草甘膦耐受性甜菜植株的鉴定方法，其特征在于，该方法包含以下步骤a)采用含有SEQ ID NO :1核苷酸序列的第一引物和含有SEQ IDNO 2核苷酸序列的第二引物，使用聚合酶链式反应，从所述甜菜植株、其部分或其种子的基因组DNA中扩增 630-700bp，优选664bp的DNA片段，和/或b)采用含有SEQ ID NO 3核苷酸序列的第一引物和含有SEQ IDNO 4核苷酸序列的第二引物，使用聚合酶链式反应，从所述甜菜植株、其部分或其种子的基因组DNA中扩增 ;3500-3900bp，优选 3706bp 的 DNA 片段，和 / 或c)采用含有SEQ ID NO 7核苷酸序列的第一引物和含有SEQ IDNO 8核苷酸序列的第二引物，使用聚合酶链式反应，从所述甜菜植株、其部分或其种子的基因组DNA中扩增 270-300bp，优选288bp的DNA片段，和/或d)采用含有SEQ ID NO 9核苷酸序列的第一引物和含有SEQ IDNO 10核苷酸序列的第二引物，使用聚合酶链式反应，从所述甜菜植株、其部分或其种子的基因组DNA中扩增710-790bp，优选751bp的DNA片段，和/或e)采用含有SEQ ID NO 14核苷酸序列的第一引物和含有SEQ IDNO 16核苷酸序列的第二引物，使用聚合酶链式反应，从所述甜菜植株的基因组DNA中扩增990-1100bp，优选1042bp的DNA片段。该方法提供了采用标准分子生物学方法对转基因草甘膦耐受性甜菜植株的检测。本发明还涉及用于鉴定转基因草甘膦耐受性甜菜植株或其细胞、组织或部分的试剂盒。试剂盒包括至少一个引物对，该引物对含有用于聚合酶链式反应的第一引物和第二引物，其可以特异地识别事件H7-1，其细胞、组织或部分。优选地，第一引物含有SEQ ID NO :1 或 SEQ ID NO :7 或 SEQ IDNO :9 或 SEQ ID NO: 14的核苷酸序列，第二引物优选含有SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :8或SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO 16的核苷酸序列。根据本发明进一步的实施方案，第一引物和第二引物各识别形成SEQ ID NO 5核苷酸序列的部分的核苷酸序列。
本发明的Sugar beet 3S0057 5043 MKl，已经于2003年2月17日保藏于国立工业和海洋微生物保藏有限公司(英国)，德国艾恩贝克，并且保藏编号为NCIMB 41158。本发明的Sugar beet 3S00575046 MK1，已经于2003年2月17日保藏于国立工业和海洋微生物保藏有限公司(英国)，德国艾恩贝克，并且保藏编号为NCIMB 41159。
下列附图用于说明本发明。其显示了 图1 二元载体和PV-BVGT08的图谱
图2通过PCR分析鉴定H7-1。分析来自18个植物的DNA样品。阴性对照=来自非转化甜菜的DNA ；阳性对照=来自H7-1原始转化体的DNA。图3通过多重PCR和在转基因事件H7-1和非转基因植株之间的区别来鉴定事件 H7-1。分析来自M个植物的DNA探针。图4pFMV-ctp2-CP4-EPSPS-E9-3’ -插入片段，其具有限制性内切酶HindIII、 XbaI、ClaI、PstI 和 BamHI 的剪切位点。图5事件H7-1的插入片段/拷贝数分析。采用PstI、Hindlll、Xbal、ClaI和 BamHI (泳道3_7)酶切10 μ g H7-1基因组DNA，用于Southern印迹分析。用BamHI酶切作为阴性对照的未转化基因组DNA(泳道8)。用BamHI酶切作为阳性对照的质粒PV-BVGT08。 泳道2和9表示分子量标准。印迹采用32P-标记的CP4-EPSPS编码区作为探针。该探针是涵盖碱基对447-1055的CP4-EPSPS基因的内部序列。图6事件H7-1的Southern印迹分析，用来评估ctp2-CP4_EPSPS编码区的完整性。 用XbaI和HindIII/BamHI酶切10 μ g与PV-BVGT08混合的H7-1基因组DNA，非转基因对照 DNA和非转基因对照DNA。印迹采用标记的CP4-EPSPS-PCR片段作为探针。图7事件H7-1的Southern印迹分析，用来评估启动子区完整性。用Hindlll， XbaI和Mcl/Xhol酶切10 μ g与PV-BVGT08混和的H7-1基因组DNA，非转基因对照DNA和非转基因对照DNA0印迹采用32P-标记的启动子片段(Hindlll) ( = PV-BVGT08序列，Bp 7972-8583)或完整的启动子-ctp2-CP4-EPSPS-E9_3，-盒(PmeI/XhoI) ( = PV-BVGT08 序列，Bp 7935-2389)作为探针。图8事件H7-1的Southern印迹分析，用来评估多腺苷酸化(Poly-Α-)区域完整性。用 EcoRI/PstI, Xbal, HindIII 和 PstI 酶切 10 μ g 与 PV-BVGT08 混和的 H7-1 基因组 DNA,非转基因对照DNA和非转基因对照DNA。印迹采用标记的Poly-A-片段(BamHI/ XhoI) ( = PV-BVGT08 序列，Bp 1702-2389)作为探针。图9作为评估事件H7-1中“主链”载体DNA缺失的探针使用的片段。图10事件H7-1的Southern印迹分析，用来评估事件H7_l中“主链"DNA的缺失。 用)(bal酶切10 μ g与PV-BVGT08混和的H7-1基因组DNA，非转基因对照DNA和非转基因对照DNA。印迹采用包含PV-BVGT08(探针1-4)的整个“主链”的标记片段作为探针。图IlPCR片段与左边界区(left border, LB)上PV-BVGT08序列之间的对比。图12PCR片段与右边界区(right border, RB)上PV-BVGT08序列之间的对比。图13插入片段右接头外的基因组DNA的分析。将大约50ng的H7-1基因组DNA、非转基因对照DNA或水用于PCR反应，PCR采用Pl (其中两个引物位于插入片段外)和P3 (其中一个引物位于插入片段内，而另一引物位于插入片段外)的引物组合。图14插入片段左接头外的基因组DNA的分析。将大约50ng的H7-1基因组DNA、非转基因对照DNA和水用于PCR反应，PCR采用P2 (其中两个引物位于插入片段外)和P4 (其中一个引物位于插入片段内，而另一引物位于插入片段外)的引物组合。图15H7-1种子批的子代图谱。图16事件H7-1的Southern印迹分析，用来评估插入的DNA是否被稳定地整合至基因组内。用BamHI，)(bal和HindIII酶切10 μ gH7_l基因组DNA(最初的转化体 H7-1-1995和三个子代，H7-1-1996至1998)和来自不同来源的非转基因对照DNA。印迹用PV-BVGT08 ( = Bp 447-1555)的标记 CP4-EPSPS 探针进行检测。
具体实施例方式参照以下实施例(仅以例举说明的方式)进一步解释本发明。以下是所使用的缩写的列表大约 V摄氏度bidest双蒸无菌水bp碱基对CTAB溴化十六烷基三甲基铵DNA脱氧核糖核酸E. coli大肠杆菌EDTA乙二胺四乙酸Fig.图h小时HCl盐酸kb千碱基对kg公斤M，mM，摩尔，毫摩尔min分钟Na2HP04/NaH2P04 磷酸钠NaCl氯化钠NaOH氢氧化钠nt核苷酸PCR聚合酶链式反应Pmol皮摩尔RNase核糖核酸核酸酶rpm每分钟转数RRRoundup Ready RT室温SDS十二烷基硫酸钠sec秒SEVAG氯仿异戊醇 Q4 1)SSC标准枸椽酸盐盐水TE三-EDTA 缓冲液TRIS三(羟甲基)氨基甲烷实施例1 事件H7-1的鉴定甜菜(Beta vulgaris)基因型3S0057已在遗传上进行修饰以便表达CP4-5-烯醇-丙酮酰-莽草酸-3-磷酸盐合酶或CP4-EPSPS，其提供了对除草剂草甘膦的耐受性， 且也可被用作可选择的标记。该转基因品系通过采用二元载体PV-BVGT08的根癌农杆菌介导的转化技术来制备。用于甜菜转化的载体的T-DNA在左和右边界区之间包含以下序列编码区，其由来自拟南芥EPSPS的叶绿体转运肽编码序列(称为ctp》组成，该编码序列与CP4-EPSPS编码序列结合，且处于35S玄参花叶病毒启动子(pFMV)和来自豌豆的 rbcS-E9-基因的3’转录终止序列的调控下。采用以下方法I. DNA 提取方法1 收集新鲜叶子或其它组织(20_100mg在1. 5ml反应管中)，加入400 μ 1提取缓冲液(如下)。用小研杵研碎组织。将混合物涡旋5秒，然后在室温下孵育30分钟至60分钟。 随后以13，OOOrpm实施离心步骤1分钟。将包含DNA的上清液注入新1. 5ml反应管内，与 120 μ 1异丙醇混合。混合物在室温下孵育2分钟。加入乙醇后形成DNA沉淀。13，OOOrpm 离心5分钟后，缓慢倾出乙醇。使样品风干。将片状沉淀物再溶于400 μ 1 H2O或TE缓冲液(如下)中。提取缓冲液(IOOml)
20 ml 5 ml Sml 2.5 ml 67.5 mlTE缓冲液IOmM Tris-HCl (pH 8.0)ImM EDTA。方法2 在1. 5ml Eppendorf管内收集新鲜植物材料QO-lOOmg)，加入500 μ 1 CTAB缓冲液(65°C )(如下)。混合物在65°C孵育1-1. 5小时，随后离心5秒。加入5 μ 1 RNase A(10mg/ml)。混合物在37°C孵育30分钟，随后离心5秒。加入200 μ 1 SEVAG。混合并在 13，OOOrpm离心10分钟后，将上清液转移到新的1. 5ml反应管中。1体积异丙醇(约400 μ 1) 与上清液小心混合。之后13，OOOrpm离心10分钟。加入600 μ 1 70%醇。通过反转管数次来洗涤片状沉淀物。混合物再一次在13，OOOrpm离心2分钟。小心地倾出乙醇。将管在干净的纸上倒置并引流。样品风干15分钟。片状沉淀物再溶于50 μ IH2O中(如下)。CTAB 缓冲液
1 M Tris ( pH 7.5 ) 5 M NaCl 0.5 M EDTA 20% SDS H2O
12
SEVAG 氯仿异戊醇04RNase-缓冲液
1.4 M
20 mM 100 mM
2% ( w/v)1)
NaCl EDTA Tris-HCl CTAB
IOmM Tris,15mM NaCl，ρΗ7·5 RNase A
IOmg RNase/ml RNase-缓冲液
(5ml bidest+50mg RNase A，等份于1. 5ml反应管中，100°C煮沸反应管30分钟， 在-20°C贮存)通常使用方法1。用这种方法可每天提取大量DNA样品而且DNA的品质是可接受的。当叶子材料较老或如果存在DNA品质问题的时候使用方法2。方法2较为复杂，需要更多时间，且所得DNA产量较低，但其具有较高的品质。通常，不进行DNA定量，通常在PCR反应中使用0. 5_1 μ 1提取的DNA溶液。II. PCR 反应:对于PCR反应，制备缓冲液+dNTP的IOx缓冲液混合物。步骤如下
母液体积IOxPCR反应最终浓度
缓沖液浓度
1 MTris-HCl,pH 8,3 100μ 0,1 M10 miΛ Trie-i1 MKCl500μ 0,5 M50 ml4 KCl100mM dATP20μι2 mM0,2 rηΜ dATP100mM dCTP20μι2 mM0,2 rηΜ dCTP100mM dTTP20μι2 mM0,2 ιηΜ dTTP100mM dGTP20μ 2 mM0,2 ΓIiM dGTP100mM MgCl2150Ml15 mM1,5 rCiM MgClaHPLC-水170μι共计1000 μ
PCR 反应(25 μ 1)DNA0.5 μ
引物 11 μ ( 20 pmol)
引物 21 μ ( 20 pmol)
Taq 聚合酶 10.2 μ (1 U,获自 Oncor Appligene
S.A.，Heidelberg,德国)
缓冲液10 χ浓度2.5 μ
水18.8 μ III.通过 PCR 鉴定 H7-1通过采用事件特异引物的PCR实行H7-1的鉴定上游引物(SEQID NO :1)H7-207U30 5' TTA ATT TTT GCA GGC GAT GGTGGC TGT TAT 3'下游引物(SEQID NO 2)H7-841L30 5' CAT ACG CAT TAG TGA GTG GGC TGT CAG GAC 3'上游引物位于插入片段之外，是甜菜基因组DNA的一部分。下游引物位于插入的 CP4-EPSPS 基因内。PCR 条件
94°C4 min步骤195°C30 sec步驟2a55°C30 sec步骤2b72°C2 min步骤2c72°C5 min步骤34°C过夜步骤4反应结束重复步骤加-c ；34次。预期的PCR产物是664bp的DNA片段(SEQ ID N0:13，见图2)。IV.通过多重PCR鉴定H7-1对于非转基因植株和转基因植株(无论是纯合的或是杂合的)的辨别，使用三种不同的引物实施多重PCR。使用下列引物H72(SEQ ID NO 14) 5' GCTCTGACACAACCGGTAAATGCATTGGCC 3‘H7S2(SEQ ID NO 15) 5' GACCCATAGTTTGATTTTAAGCACGACATG 3‘H7R2(SEQ ID NO 16) 5' GCAGATTCTGCTAACTTGCGCCATCGGAG 3‘PCR 条件940C 2 min步骤ι94°C 1 sec步骤 2a60°C 45 sec步骤2b72°C 90 sec步骤2c72°C 5 min步骤34°C 过夜步骤4反应结束步骤加-c重复；34次。非转基因植株仅显现一段约350bp的PCR片段。纯合的转基因植株显现一段约 1. 042kb的片段。杂合的植物显现两个片段(见图3)。实施例2 事件H7-1的特征化实施分子分析来对H7-1中存在的整合的DNA进行特征化。具体而言，测定插入片段数目(甜菜基因组内整合位点的数目)，拷贝数(一个基因座内DNA片段的数目)，插入的编码区的完整性及其调控元件，PFMV启动子和E9-3’转录终止序列，用于转化的载体 “主链”序列的缺失和插入片段的稳定遗传性。此外，鉴定侧接于DNA插入片段的序列。通过使用Southern印迹，PCR和反向PCR技术对甜菜转化事件H7-1的插入的DNA 进行特征描述。其中包括阳性对照和阴性对照(PV-BVGT08，非转基因植株DNA)，并且用与试样(H7-1)同样的方法处理。从1997年种植的事件H7-1植物批号74903H中分离DNA。还从1995年原始转化体 H7-1/3S0057( = 6401VH)和 1996年，1997年和 1998年生产的三个其它子代(H7-1/64801H， H7-1/74922H 和 H7-1/83002S)中分离 DNA。非转基因甜菜品系3S0057作为对照。此外，甜菜品系5R7150,8K1180和6S0085 用作阴性对照。该品系是用于培育传统的甜菜的普通非转基因品系。参照物与用于转化的质粒PV-BVGT08相对应。将质粒DNA和来自对照甜菜品系的 DNA混合在一起，用限制性内切酶酶切，并与试样平行在琼脂糖凝胶上进行电泳分离。质粒可作为预期片段的分子量标记并可作为阳性杂交对照。以代表低于1拷贝的分析元件的浓度，将质粒DNA与基因组植物DNA混合，以便证实Southern印迹法的敏感性( 10 μ g基因组 DNA 和 28pg PV-BVGT08-DNA)。使用分子量标准参照物 RA0UL (0NC0R/Appligene， 货号#160673)估测分子大小。DNA 分离用研钵和研杵将来自事件H7-1的批号74903H的植物组织(l_3g湿重)在液氮中磨为细粉。粉末转移到50ml Oakridge管，然后加入7. 5ml预热(60°C )的CTAB缓冲液 (2% CTAB, IOOmM Tris-HCl, 20mM EDTA ρΗ 8. 0，1· 4M NaCl 和 0. 2%巯基乙醇)。采用间歇搅拌将样品在65°C孵育大约30分钟。在样品中加入等体积(8ml)的RT氯仿异戊醇 (24 lv/v)混合物。将混悬液反转混和，然后离心(10min,9000rpm)使两相分离。水相转移到新50ml Oakridge管，然后加入5 ml异丙醇使DNA沉淀。离心Qmin，9000rpm)得到片状沉淀的DNA并弃去上清液。沉淀的DNA用76%乙醇和IOmM乙酸铵的洗涤溶液孵育大约20分钟。在离心分离和倾析上清液后，真空干燥DNA并将其再溶于TE中，pH 8. 04°C过夜。作为可选方法，通过获自Qiagen(DUsseldorf，德国，货号#68163)的DNeasy Plant Maxi Kit分离DNA。根据厂商说明实施DNA分离。作为其它的可选方法，通过获自Qiagen(DUSSeldorf，德国，货号#69103)的 DNeasy Plant Mini Kits分离DNA。根据厂商说明实施DNA分离。DNA定量和限制件内切酶酶切采用 LKB Biochrom UV/可视分光光度计(Amersham Pharmacia, Freiburg, 德国)实施DNA定量，或可选地，在琼脂糖凝胶电泳后通过用RFLPscan程序 (MWG-Biotech, Ebersberg,德国)扫描 DNA，完成 DNA 定量。采用获自 Gibco/Life ^Technologies (Karlsruhe，德国)(货号 #10496-016)的High DNA Mass Ladder 作为校准标准。限制性内切酶购自 Boehringer Mannheim (Mannheim,德国)、Stratagene (Amsterdam, Niederlande)或New England Biolabs (Frankfurt，德国)并且根据厂商手册进行使用。DNA探针制备从E. coli培养物中分离PV-BVGT08DNA。通过采用相应限制性内切酶酶切，然后用琼脂糖凝胶电泳或聚合酶链式反应(PCR)分离，制备与CP4-EPSPS编码区，35S启动子， E9-3’ -poly-A-区，35S-ctp2-CP4-EPSPS-E9-3’ -盒和“主链”区同源的探针模板。产物用 BIO 101 (La Jolla, CA)的 Gene Clean II 试齐[J盒纯化。采用 Amersham—Pharmacia Biotech Europe (Freiburg,德国)的 Megaprime DNA 标记系统实施用 ％P_dCTP 或 32P_dATP 对探针 (25pg)的标记。Southern 印迹分析限制性内切酶处理的DNA的样品用琼脂糖凝胶电泳在 35伏特分离 15小时。 凝胶成像后，在0. 25M HCl-溶液中浸泡凝胶15分钟使DNA脱嘌呤，凝胶在0. 5M NaOH, 1. 5M NaCl的变性溶液中持续轻柔搅拌孵育30分钟使DNA变性，最后通过在若干体积的2M NaCl 和IM Tris-HCl，pH 5. 5的溶液中浸泡2小时使DNA中和。采用获自Stratagene的Pressure Blotter,根据厂商手册，将获自琼脂糖凝胶的DNA转移至Hybond-N 尼龙膜(Amersham Pharmacia Biotech Europe，Freiburg，德国)。在将滤器置于 2xSSPE (20xSSPE :3. 6MNaCl, 20mM EDTA，0. 2M NaH2P04/Na2HP04pH7. 4)中浸泡 I5 分钟后，通过紫外线 CTransilluminator Pharmacia, Freiburg，德国)照射1分钟以及在真空干燥箱中80°C烘烤1小时从而将 DNA固定于膜上。在50%甲酰胺，5xSSC，0. 月桂酰肌氨酸，0.02% SDS和2%封闭剂 (Boehringer Mannheim，德国，货号#1096176)的水溶液中将印迹预杂交4小时。与放射标记的探针的杂交在新鲜的预杂交溶液中于42°C经过16-18小时而完成。在杂交后，膜在 2xSSC中于42 °C洗涤5分钟，在hSSC，l% SDS中于65 °C洗涤20分钟，然后在0. 2xSSC, 0.1% SDS中于68°C洗涤15分钟，洗两次。通过采用Biomax-MS 胶片连同Kodak Biomax MS 增感屏对印迹曝光从而获得印迹的放射自显影图像。侧翼5，和3，基因组序列的鉴定采用反向PCR技术鉴定转基因-和植株基因组DNA之间的接头。按照上面描述纯化基因组DNA。大约Iy g的DNA在分离的反应中被限制性核酸酶TaqI、AluI, NdeIII或 RsaI酶切。使用T4-连接酶将酶切的DNA片段再过夜连接，然后进行PCR反应。使用获自 NBI (National Biosciences, Inc. , Plymouth, Michigan)的引物分析软件 OUGO 获得多种反引物组合。该反向PCR扩增产生的片段用凝胶电泳分离，从凝胶上切取，然后采用Gene Clean II 试剂盒纯化。使用来自 hvitrogen(Groningen，Niederlande)的TOPOtmTA cloning 试
剂盒将纯化的片段克隆至载体pCR 2. 1。将插入片段提交给MWG-Biotech (m^ersberg， 德国)进行测序。用 Mac Molly Tetra DNA 分析软件(SoftGene GmbH，Bochold，德国)
实施对所得序列数据的分析。PCR 分析采用DNAeasy Plant Mini 试剂盒(Qiagen，Diisseldorf，德国)，根据厂商说明，制备基因组DNA。将大约50ng的基因组DNA用于PCR。反应设置为95°C 30秒，55°C 30秒， 和72°C 2分钟进行35个循环。在PTC200循环仪(Biozym，Oldendorf，德国)中完成PCR。 通过琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。1.插入片段数量对H7-1评估插入片段数量，转基因DNA进入甜菜基因组的整合位点数量。为了测定插入片段数量，用限制性内切酶HindIIIJbaI和BamHI酶切基因组DNA。作为阴性对照的来自未转化的对照植物的DNA(表示相同遗传背景)用Hind III酶切。采用转化载体 DNA (PV-BVGT08)作为阳性对照。XbaI和BamHI在PV-BVGT08中仅剪切一次且不在使用的标记CP4-EPSPS探针内剪切(见图4)。HindIII在PV-BVGT08中剪切三次，但所有三个位置均位于探针的外面且在同侧上，5’ (相对于探针)。因此，各酶会释放出单个DNA片段，该片段可与CP4-EPSPS探针杂交，并可包含插入的DNA和邻近的基因组植物DNA的部分。检测到的片段数量表明在事件中存在的插入片段的数量。结果如图5所示。分别使用酶HindIII JbaI或BamHI酶切后，仅发现单个杂交片段。来自HindIII 消化(泳道4)的5. 2kb片段，来自^CbaI消化(泳道5)的41Λ片段和来自BamHI消化(泳道7)的大约111Λ片段显示出转化体H7-1表现单个整合事件(图4)。泳道1中的强信号表示线性化PV-BVGT08质粒。其它的微弱信号涉及少量未经酶切的PV-BVGT08或涉及非特异性背景杂交信号。2.拷贝数理论上，一个整合位点可由大于一个拷贝的插入的DNA组成。但是由于前述限制性分析的片段大小，故上述情况是不可能的。如果H7-1中存在大于一个拷贝的插入的DNA， 则其它的片段则会被检测到。这也可通过用限制性内切酶I3StI酶切进行证实。I^stI在左和右边界序列中剪切两次。限制性酶切部位之一位于CP4-EPSPS编码区内，因此在酶切后， 可以预期两个与CP4-EPSPS探针杂交的片段。预期片段之一与约1. 2kb的内部片段相对应。 第二个片段应是边界片段。而且，如果存在大于一个拷贝，其它的片段应该是可检测的。但是结果显示I3StI按预期的那样剪切DNA。检测到1. 2kb的内部片段和仅一个约4. 9kb的其它片段(图5:泳道3，图4)。用ClaI剪切DNA作为附加的内部对照(图5 泳道6，图4)。与预期中一样，2. 4kb 的单个片段杂交，这是因为ClaI在所用的CP4- EPSPS片段的左手侧和右手侧外部剪切两次。这一结果也是整合的DNA片段完整性的证明并且与以下给出的结果一致。
质粒PV-BVGT08 (PV-BVGT08 = 8590bp)与 CP4-EPSPS 片段的杂交产生 8. 6kb 信号 (图5，泳道1)，如所预期的那样。第二条较小的非常微弱的带是由于PV-BVGT08的不完全限制性。概括而言，试验显示出转化的甜菜品系H7-1含有在植物基因组中的PV-BVGT08的 T-DNA单拷贝整合。3.编码区的完整件通过用酶HindIII 酶切 P-FMV，HindIII 加 BamHI 酶切 ctp2_CP4_EPSPS 和 EcoRI 加I^stI酶切E9-3’ -非翻译区来测定具有各个元件的CP4-EPSPS基因盒的完整性(就各元件而言，为P-FMV启动子，ctp2-CP4-EPSPS编码区和E9-3’ -非翻译区))。采用McI加 XhoI酶切P-FMV-ctp2-CP4-EPSPS区域和E9-3’ -区域来实施附加试验。采用相同的酶酶切与非转基因甜菜DNA混合的质粒DNA和单独的非转基因甜菜DNA，分别作为阳性对照和阴性对照。这些酶在预期的DNA插入片段内，在左和右T-DNA边界之间，剪切(见质粒图谱， 图1中)，所以，如果相应元件是完整的，则H7-1DNA和PV-BVGT08DNA中的杂交片段大小应相同。用XbaI酶切DNA作为另外的对照。XbaI在启动子和ctp2-CP4_EPSPS编码区之间剪切一次。因此，可以预期含有PV-BVGT08 DNA的8. 6kb片段，而在H7-1的情况下为与 PV-BVGT08片段相比在大小上不同的边界片段。结果如图6，7和8所示。图6 用HindIII和BamHI的酶切释放出CP4-EPSPS基因，用PCR产生的CP4-EPSPS 片段探测印迹。阴性对照(泳道6)未显示任何杂交带。来自事件H7-1的基因组DNA和与非转基因DNA混和的质粒PV-BVGT08两者都产生大约1. 7kb片段，这与预期大小相符。用 XbaI的酶切产生预期的线性化PV-BVGT08的8. 6kb片段。对于事件H7-1，酶切产生大约 4. Okb的边界片段(同样参见图4和5)。同样，阴性对照未显示任何信号。图7 用HindIII的酶切释放出玄参花叶病毒启动子，用PCR产生的启动子片段探测印迹。阴性对照(泳道5)未显示任何杂交信号。来自事件H7-1的基因组DNA和与非转基因DNA混和的质粒PV- BVGT08两者都产生大小约0. 6kb的杂交片段。该片段符合启动子的预期大小(泳道4和6)。用)(bal的酶切产生预期的线性化PV-BVGT08的8. 6kb片段和来自事件H7_l的大约1. 3kb大小的左边界片段(泳道1和3)。该1. 3kb片段也是对事件H7-1仅包含转基因的单拷贝的附加证明。同样，阴性对照(泳道2)未显示任何信号。用SacIAhoI的酶切释放出启动子联同CP4-EPSPS编码区和poly-A_区。与完整的启动子-ctp2-CP4-EPSPS-多腺苷酸化信号盒(PmelAhoI片段)杂交产生预期的2. 3kb 启动子-ctp2-CP4-EPSPS和0. 7kb多腺苷酸化信号片段，此两者均含有与非转基因DNA混和的PV-BVGT08 DNA和H7-1的基因组DNA (泳道9和11)。图8 用I^stI和EcoRI的酶切释放出E9_3’多腺苷酸化信号，用多腺苷酸化信号片段探测印迹。阴性对照(泳道幻未显示任何杂交带。与非转基因DNA混合的质粒PV-BVGT08 和来自事件H7-1的基因组DNA两者都产生大约0.61Λ大小的片段，这与预期大小相符。用 XbaI的酶切产生预期的线性化PV-BVGT08的8. 6kb片段和含有事件H7-1的大约4. Okb大小的边界片段。
用I^stI的酶切释放出E9-3’多腺苷酸化信号联同0. 5kb的CP4-EPSPS编码区的 3，部分。产生的1.21Λ片段可按预期的用基因组H7-1DNA和PV-BVGT08 DNA进行检测。用HindIII的酶切得到线性化PV-BVGT08减去启动子片段的8. Okb片段(泳道 13)和含有H7-1的5. 2kb边界片段(泳道11)。来自HindIII酶切的单个5. 2kb片段和来自)(bal酶切的单个4. Okb片段也是对事件H7-1仅包含一个拷贝插入的DNA的附加证明。 同样，阴性对照未显示任何信号。概括而言，印迹结果证明了，转化的DNA的所有元件是完整的，且事件H7-1包含单个完整的CTP2-CP4-EPSPS编码区和其调控元件，pFMV启动子和E9-3’转录终止序列。4.用于检测“主链”片段的分析Ti-质粒“主链”区的定义是与左和右边界序列接界的T-DNA的外部区域，其由用于细菌复制和细菌选择的起始基因和选择基因组成，而且其在农杆菌介导的转化时，通常不被转移至植物基因组。为了确定在事件H7-1中不存在“主链”载体DNA，用限制性内切酶)(bal酶切来自H7-1的基因组DNA，来自未转化对照的基因组DNA，和与PV-BVGT08 DNA 混和的来自H7-1的基因组DNA，然后用三个重叠的由PCR产生的探针进行检测，所述探针包括完整主链序列。第四个探针具有在一个片段中的完整“主链”。所用探针表示“主链”序列(见图9):1 :bp 2730-53702 :bp 5278-64193 :bp 6302-78514 :bp 2730-7851图10显示Southern印迹分析的结果。泳道6，10，14和18 用完整“主链”的“主链”片段探测酶切的H7-1的基因组DNA，其未显示任何杂交带。仅泳道4，8，12，16和20 与 PV-BVGT08 DNA混和的H7-1的基因组DNA显示8. 6kb的带，如预期的那样。条带表示线性化PV-BVGT08 DNA。泳道2和4 :H7-1基因组DNA和与PV-BVGT08混和且与CP4-EPSPS片段杂交的H7-1 基因组DNA显示出杂交信号。泳道2中41Λ的带表示右边界片段，泳道4的两条带也表示 4. Okb长的右边界片段和8. 6kb大小的线性化PV-BVGT08质粒。两条带具有相同的强度。 这清楚地显示出加入的PV-BVGT08 DNA的浓度与H7-1DNA中CP4-EPSPS元件的浓度相当。 使用的质粒DNA的浓度等于0. 5拷贝。如果H7-1基因组中存在整合的“主链”序列，则可检测到明显的信号。这些结果证明了 H7-1不包含任何用于转化的质粒的可检测“主链”序列。该结果也得到5’和3’基因组侧翼区分析数据的支持(如下)。5.侧翼5，和3，基因组序列的鉴定农杆菌介导的转化通常导致左和右边界之间的所有序列整合至植物基因组中。整合质粒DNA的5’和3’末端应分别位于左或右边界序列内或与之邻近。因此可用反向PCR 技术识别该区域。对克隆的PCR产物测序，然后将序列数据与PV-BVGT08序列比较。图11显示来自克隆的反向PCR片段的序列(D1U.RPT)(=基因组H7-1，上游序列) 的排列，该序列通过用于左边界区域分析的引物获得，与PV-BVGT08序列(下游序列)的比对。两序列的比较显示同源性恰在边界序列内终止。
图12显示来自克隆的反向PCR片段的序列(B3UNI. RPT)(=基因组H7_l，上游序列)的排列，该序列通过用于右边界区域分析的引物获得，与PV-BVGT08序列(下游序列) 的比对。两序列的比较显示同源性在边界序列前18个核苷酸已经停止。总的来说，这清楚地显示出，Ti-质粒PV-BVGT08的左和右边界之间的序列被正确地整合。序列在边界之内或紧接边界之前停止。这些数据支持“主链”分析的结果，即没有边界区之外的“主链”序列被整合至H7-1基因组内。为确定甜菜事件H7-1中插入片段的右和左侧上侧翼序列是否为完整的植物基因组序列，采用引物组合Pl，P2，P3和P4实施反向PCR分析。引物组合Pl和P2的引物位于插入片段外。如果位于事件H7-1中的插入片段基因座的DNA与未转化对照的DNA相同，则PCR将产生两个PCR片段，该片段表示来自两个引物组合的合成。引物组合P3和P4的引物按如下方式设计，即使得各引物之一位于CP4-EPSPS 插入片段内而另一引物位于插入片段外(在植物基因组DNA内)。由此PCR应仅产生来自事件H7-1的DNA的片段。来自反向PCR技术的序列数据联合来自PV-BVGT08载体的数据，可产生包含H7_l 插入片段(PV-BVGT08序列)，右和左接头区和其它甜菜基因组DNA(SEQ ID NO :5)的序列。对于鉴别转基因至植物基因组DNA接头(事件特异性的鉴别)和对于插入片段左和右侧的基因组DNA区域，使用以下引物组合Pl组合(用于分析右边界区外基因组DNA的引物，SEQ IDNO 18, SEQ ID NO 19)上游引物5'CGG TAA ATG CAT TGG CCT TTG TT下游引物5'CAC CCA GAT CCC AAT AAA ACC GTA AT预期PCR 产物 MlbpP2组合(用于分析左边界区外基因组DNA的引物，SEQ ID NO 20, SEQ ID NO 21)上游引物5'AAA TGG TTG TAG ATA AAT AAG GAA ATC A下游引物5'ACA TGT TTG AGC ACT CTT CTT GT预期PCR 产物 377bpP3组合(用于分析转基因至植物基因组DNA接头的引物，SEQ IDNO :7,SEQ ID NO: 8)上游引物5'ATG CAT TGG CCT TTG TTT TTG AT下游引物5'TGT CGT TTC CCG CCT TCA G预期PCR 产物 288bp (SEQ ID NO 11)P4组合(用于分析转基因至植物基因组DNA接头的引物，SEQ IDNO :9,SEQ ID NO: 10)上游引物5'CGC TGC GGA CAT CTA CAT TTT TGA AT下游引物5'AGT TAA CTT TCC ACT TAT CGG GGC ACT G预期PCR 产物 75 Ibp (SEQ ID NO 12)采用事件H7-1DNA和来自非转基因对照植物的DNA的PCR试验(采用引物组合 P3，其具有位于H7-1插入片段内部的一个引物)可产生仅含事件H7-1DNA的片段。相反， 采用引物组合Pl (与插入片段外部序列同源)的PCR试验可产生同时含有事件H7-1和非转基因对照DNA的片段。这些结果见图13。
该结果表明紧接插入片段右接头的序列存在于转基因事件H7-1DNA中和来自非转基因植株的DNA中。可以得出如下结论，即事件H7-1插入片段外的该DNA是非转基因基因组DNA。采用事件H7-1DNA和来自非转基因对照植物的DNA，以及使用引物组合P4 (其含有一个位于CP4-EPSPS插入片段内的引物)所实施的PCR试验产生仅含事件H7-1DNA的片段。相反，使用引物组合P2(与插入片段外部序列同源)的PCR试验产生同时含有有事件 H7-1的DNA和非转基因对照DNA的片段。(图14)。该结果表明紧接插入片段左接头的序列存在于转基因事件H7-1的DNA中和来自非转基因植株的DNA中。可以得出如下结论，即事件H7-1外的DNA是非转基因基因组DNA。概括而言，可以描述如下，即甜菜事件H7-1插入片段外部的序列与非转基因植株中存在的序列相同。可以得出如下结论，这些序列是用于转化的亲本品系和其它常规甜菜品系中存在的植物基因组序列。6.子代稳定件为了证明整合DNA的稳定性，将原始转化事件H7-1和通过与非转基甜菜品系自花传粉得到的该品系的三个子代(64801H，74922H和83002S;见图1 进行比较。最初转化品系和子代产于1995年，1996年，1997年和1998年。四个不同的非转基因甜菜品系(3S0057，5R7150，8K1180，6S0085)作为对照进行分析。分别用)(bal，HindIII和BamHI酶切所有DNA，然后与标记的CP4-EPSPS片段杂交。 为了证明T-DNA被稳定地整合至植物基因组中，采用相同限制性内切酶酶切的H7-1子代的所有泳道应表现为准确相同大小的条带。来自H7-1子代的DNA泳道3_6显示出预期片段用BamHI酶切的DNA为大约111Λ 的条带，用)(bal酶切产生4. Okb的片段而HindIII限制性酶切产生5. 2kb的条带。来自相同限制性酶切但来自不同年份的所有条带在其大小上相同。所有非转基因品系未显示任何信号(图16)。这些结果证明了引入的序列被稳定地整合至基因组DNA中并被稳定地遗传。
序列记录-自由文本
SEQ ID 5
<223>:用侧翼3'-和5'-序列插入的DNA
SEQ ID 6
<223>=PCR--产物
SEQ ID :11
<223> =PCR--产物
SEQ ID 12
<223>=PCR--产物
SEQ ID 13
<223>=PCR--产物
SEQID 17
<223>=PCR--产物
权利要求
1.草甘膦耐受性甜菜植株细胞，其特征在于a)甜菜植株获自保藏于NCIMB，Aberdeen，苏格兰，英国，保藏号为NCIMB41158或 NCIMB 41159的种子，和/或b)采用含有SEQID NO :1核苷酸序列的第一引物和含有SEQID NO :2核苷酸序列的第二引物，使用聚合酶链式反应，可从所述甜菜植株、其部分或其种子的基因组DNA中扩增 630-700bp的DNA片段，和/或c)采用含有SEQID NO :3核苷酸序列的第一引物和含有SEQID NO :4核苷酸序列的第二引物，使用聚合酶链式反应，可从所述甜菜植株、其部分或其种子的基因组DNA中扩增 3500-3900bp 的 DNA 片段，和 / 或d)采用含有SEQID NO :7核苷酸序列的第一引物和含有SEQID NO :8核苷酸序列的第二引物，使用聚合酶链式反应，可从所述甜菜植株、其部分或其种子的基因组DNA中扩增 270-300bp的DNA片段，和/或e)采用含有SEQID NO :9核苷酸序列的第一引物和含有SEQID N0:10核苷酸序列的第二引物，使用聚合酶链式反应，可从所述甜菜植株、其部分或其种子的基因组DNA中扩增 710-790bp的DNA片段，和/或f)采用含有SEQID NO: 14核苷酸序列的第一引物和含有SEQ ID NO 16核苷酸序列的第二引物，使用聚合酶链式反应，可从所述甜菜植株的基因组DNA中扩增990-1100bp的 DNA片段。
2.根据权利要求1的草甘膦耐受性甜菜植株细胞，其特征在于，在b)中，可从所述甜菜植株、其部分或其种子的基因组DNA中扩增664bp的DNA片段。
3.根据权利要求1的草甘膦耐受性甜菜植株细胞，其特征在于，在c)中，可从所述甜菜植株、其部分或其种子的基因组DNA中扩增3706bp的DNA片段。
4.根据权利要求1的草甘膦耐受性甜菜植株细胞，其特征在于，在d)中，可从所述甜菜植株、其部分或其种子的基因组DNA中扩增^Sbp的DNA片段。
5.根据权利要求1的草甘膦耐受性甜菜植株细胞，其特征在于，在e)中，可从所述甜菜植株、其部分或其种子的基因组DNA中扩增751bp的DNA片段。
6.根据权利要求1的草甘膦耐受性甜菜植株细胞，其特征在于，在f)中，可从所述甜菜植株的基因组DNA中扩增1042bp的DNA片段。
7.根据权利要求1至6中任一项的草甘膦耐受性甜菜植株细胞，其特征在于，所述 3706bp DNA片段含有SEQ ID NO 6核苷酸序列或表现出与SEQ ID NO 6核苷酸序列至少 95%的同一性。
8.根据权利要求7的草甘膦耐受性甜菜植株细胞，其特征在于，所述3706bpDNA片段表现出与SEQ ID NO :6核苷酸序列至少99%的同一性。
9.根据权利要求8的草甘膦耐受性甜菜植株细胞，其特征在于，所述3706bpDNA片段表现出与SEQ ID NO :6核苷酸序列至少99. 9%的同一性。
10.根据权利要求1至6中任一项的草甘膦耐受性甜菜植株细胞，其特征在于，所述 664bp DNA片段含有SEQ ID NO 13核苷酸序列或表现出与SEQ ID NO :13核苷酸序列至少 95%的同一性。
11.根据权利要求10的草甘膦耐受性甜菜植株细胞，其特征在于，所述664bpDNA片段表现出与SEQ ID NO :13核苷酸序列至少99%的同一性。
12.根据权利要求11的草甘膦耐受性甜菜植株细胞，其特征在于，所述664bpDNA片段表现出与SEQ ID NO :13核苷酸序列至少99. 9%的同一性。
13.根据权利要求1至6中任一项的草甘膦耐受性甜菜植株细胞，其特征在于，所述 288bp DNA片段含有SEQ ID NO :11核苷酸序列或表现出与SEQ ID NO :11核苷酸序列至少 95%的同一性。
14.根据权利要求13的草甘膦耐受性甜菜植株细胞，其特征在于，所述^SbpDNA片段表现出与SEQ ID NO :11核苷酸序列至少99%的同一性。
15.根据权利要求14的草甘膦耐受性甜菜植株细胞，其特征在于，所述^SbpDNA片段表现出与SEQ ID NO :11核苷酸序列至少99. 9%的同一性。
16.根据权利要求1至6中任一项的草甘膦耐受性甜菜植株细胞，其特征在于，所述 751bp DNA片段含有SEQ ID NO 12核苷酸序列或表现出与SEQ ID NO :12核苷酸序列至少 95%的同一性。
17.根据权利要求16的草甘膦耐受性甜菜植株细胞，其特征在于，所述751bpDNA片段表现出与SEQ ID NO :12核苷酸序列至少99%的同一性。
18.根据权利要求17的草甘膦耐受性甜菜植株细胞，其特征在于，所述751bpDNA片段表现出与SEQ ID NO :12核苷酸序列至少99. 9%的同一性。
19.根据权利要求1至6中任一项的草甘膦耐受性甜菜植株细胞，其特征在于，所述 1042bp DNA片段含有SEQ ID NO 17核苷酸序列或表现出与SEQ ID NO 17核苷酸序列至少95%的同一性。
20.根据权利要求19的草甘膦耐受性甜菜植株细胞，其特征在于，所述1042bpDNA片段表现出与SEQ ID NO :17核苷酸序列至少99%的同一性。
21.根据权利要求20的草甘膦耐受性甜菜植株细胞，其特征在于，所述1042bpDNA片段表现出与SEQ ID NO :17核苷酸序列至少99. 9%的同一性。
22.来自根据权利要求1-19之任一项的植株细胞的组织。
23.草甘膦耐受性甜菜植株的鉴定方法，其特征在于，该方法包含以下步骤a)采用含有SEQID NO :1核苷酸序列的第一引物和含有SEQID NO :2核苷酸序列的第二引物，使用聚合酶链式反应，从所述甜菜植株、其部分或其种子的基因组DNA中扩增 630-700bp的DNA片段，和/或b)采用含有SEQID NO :3核苷酸序列的第一引物和含有SEQID NO :4核苷酸序列的第二引物，使用聚合酶链式反应，从所述甜菜植株、其部分或其种子的基因组DNA中扩增 3500-3900bp 的 DNA 片段，和 / 或c)采用含有SEQID NO :7核苷酸序列的第一引物和含有SEQID NO :8核苷酸序列的第二引物，使用聚合酶链式反应，从所述甜菜植株、其部分或其种子的基因组DNA中扩增 270-300bp的DNA片段，和/或d)采用含有SEQID NO :9核苷酸序列的第一引物和含有SEQID NO :10核苷酸序列的第二引物，使用聚合酶链式反应，从所述甜菜植株、其部分或其种子的基因组DNA中扩增 710-790bp的DNA片段，和/或e)采用含有SEQID NO: 14核苷酸序列的第一引物和含有SEQ ID N0:16核苷酸序列的第二引物，使用聚合酶链式反应，从所述甜菜植株的基因组DNA中扩增990-1100bp的DNA 片段。
24.根据权利要求23的草甘膦耐受性甜菜植株的鉴定方法，其特征在于，在a)中，从所述甜菜植株、其部分或其种子的基因组DNA中扩增664bp的DNA片段。
25.根据权利要求23的草甘膦耐受性甜菜植株的鉴定方法，其特征在于，在b)中，从所述甜菜植株、其部分或其种子的基因组DNA中扩增3706bp的DNA片段。
26.根据权利要求23的草甘膦耐受性甜菜植株的鉴定方法，其特征在于，在c)中，从所述甜菜植株、其部分或其种子的基因组DNA中扩增^Sbp的DNA片段。
27.根据权利要求23的草甘膦耐受性甜菜植株的鉴定方法，其特征在于，在d)中，从所述甜菜植株、其部分或其种子的基因组DNA中扩增751bp的DNA片段。
28.根据权利要求23的草甘膦耐受性甜菜植株的鉴定方法，其特征在于，在e)中，从所述甜菜植株的基因组DNA中扩增1042bp的DNA片段。
29.用于鉴定转基因草甘膦耐受性甜菜植株、其细胞、组织或部分的试剂盒，其包含至少一个引物对，所述引物对含有用于聚合酶链式反应的第一引物和第二引物，其中第一引物识别掺入至所述植株基因组的外源DNA内的序列，第二引物识别所述DNA的3’或5’侧翼区内的序列，由此所述植株是根据权利要求1-19之任一项的植株。
30.用于鉴定转基因草甘膦耐受性甜菜植株、其细胞、组织或部分的试剂盒，其包含至少一个引物对，所述引物对含有用于聚合酶链式反应的第一引物和第二引物，其中第一引物识别掺入至所述植株基因组的外源DNA内的序列，第二引物识别所述DNA的3’或5’侧翼区内的序列，其特征在于a)第一引物含有SEQID NO :1核苷酸序列和第二引物含有SEQ ID NO :2核苷酸序列， 和/或b)第一引物含有SEQID NO :7核苷酸序列和第二引物含有SEQ ID NO :8核苷酸序列， 和/或c)第一引物含有SEQID NO :9核苷酸序列和第二引物含有SEQ ID N0:10核苷酸序列， 和/或d)第一引物含有SEQID NO 14核苷酸序列和第二引物含有SEQ ID NO 16核苷酸序列。
31.根据权利要求四或30的试剂盒，其特征在于，第一引物和第二引物识别形成SEQ ID NO :5核苷酸序列的部分的核苷酸序列。
32.—种制备权利要求1至6中任一项的草甘膦耐受性甜菜植株细胞的方法，其特征在于该方法包括将农杆菌-CP4-EPSPS-基因稳定地掺入植物基因组中，并且所述细胞通过采用二元载体PV-BVGT08的农杆菌介导的转化技术进行制备，其中所述载体在左和右边界区之间包含下列序列编码区，其由来自拟南芥EPSPS的叶绿体转运肽编码序列(称为 ctp2)组成，该编码序列与CP4-EPSPS编码序列结合，且处于玄参花叶病毒启动子(pFMV)和来自豌豆的E9-3’转录终止序列的调控下。
33.一种制备权利要求22的植株细胞的组织的方法，其特征在于该方法包括将农杆菌-CP4-EPSPS-基因稳定地掺入植物基因组中，并且所述组织通过采用二元载体 PV-BVGT08的农杆菌介导的转化技术进行制备，其中所述载体在左和右边界区之间包含下列序列编码区，其由来自拟南芥EPSPS的叶绿体转运肽编码序列(称为ctp》组成，该编码序列与CP4-EPSPS编码序列结合，且处于玄参花叶病毒启动子(pFMV)和来自豌豆的 E9-3’转录终止序列的调控下。
34.一种制备草甘膦耐受性甜菜植株的方法，其中所述植物的特征在于a)甜菜植株获自保藏于NCIMB，Aberdeen，苏格兰，英国，保藏号为NCIMB41158或 NCIMB 41159的种子，和/或b)采用含有SEQID NO :1核苷酸序列的第一引物和含有SEQ IDNO :2核苷酸序列的第二引物，使用聚合酶链式反应，可从所述甜菜植株、其部分或其种子的基因组DNA中扩增 630-700bp的DNA片段，和/或c)采用含有SEQID NO :3核苷酸序列的第一引物和含有SEQ IDNO :4核苷酸序列的第二引物，使用聚合酶链式反应，可从所述甜菜植株、其部分或其种子的基因组DNA中扩增 3500-3900bp 的 DNA 片段，和 / 或d)采用含有SEQID NO :7核苷酸序列的第一引物和含有SEQ IDNO :8核苷酸序列的第二引物，使用聚合酶链式反应，可从所述甜菜植株、其部分或其种子的基因组DNA中扩增 270-300bp的DNA片段，和/或e)采用含有SEQID NO :9核苷酸序列的第一引物和含有SEQ IDNO :10核苷酸序列的第二引物，使用聚合酶链式反应，可从所述甜菜植株、其部分或其种子的基因组DNA中扩增 710-790bp的DNA片段，和/或f)采用含有SEQID NO :14核苷酸序列的第一引物和含有SEQID N0:16核苷酸序列的第二引物，使用聚合酶链式反应，可从所述甜菜植株、其部分或其种子的基因组DNA中扩增 990-1 IOObp 的 DNA 片段，其特征在于，该方法包括将农杆菌-CP4-EPSPS-基因稳定地掺入植物基因组中，并且所述植株通过采用二元载体PV-BVGT08的农杆菌介导的转化技术进行制备，其中所述载体在左和右边界区之间包含下列序列编码区，其由来自拟南芥EPSPS的叶绿体转运肽编码序列(称为ctp2)组成，该编码序列与CP4-EPSPS编码序列结合，且处于玄参花叶病毒启动子(pFMV)和来自豌豆的E9-3’转录终止序列的调控下。
35.根据权利要求34的方法，其特征在于，在b)中，可从所述甜菜植株、其部分或其种子的基因组DNA中扩增664bp的DNA片段。
36.根据权利要求34的方法，其特征在于，在c)中，可从所述甜菜植株、其部分或其种子的基因组DNA中扩增3706bp的DNA片段。
37.根据权利要求34的方法，其特征在于，在d)中，可从所述甜菜植株、其部分或其种子的基因组DNA中扩增的DNA片段。
38.根据权利要求34的方法，其特征在于，在e)中，可从所述甜菜植株、其部分或其种子的基因组DNA中扩增751bp的DNA片段。
39.根据权利要求34的方法，其特征在于，在f)中，可从所述甜菜植株、其部分或其种子的基因组DNA中扩增1042bp的DNA片段。
40.一种制备草甘膦耐受性甜菜植株的种子的方法，其中所述植物的特征在于a)甜菜植株获自保藏于NCIMB，Aberdeen，苏格兰，英国，保藏号为NCIMB41158或 NCIMB 41159的种子，和/或b)采用含有SEQID NO :1核苷酸序列的第一引物和含有SEQ IDNO :2核苷酸序列的第二引物，使用聚合酶链式反应，可从所述甜菜植株、其部分或其种子的基因组DNA中扩增 630-700bp的DNA片段，和/或c)采用含有SEQID NO :3核苷酸序列的第一引物和含有SEQ IDNO :4核苷酸序列的第二引物，使用聚合酶链式反应，可从所述甜菜植株、其部分或其种子的基因组DNA中扩增 3500-3900bp 的 DNA 片段，和 / 或d)采用含有SEQID NO :7核苷酸序列的第一引物和含有SEQ IDNO :8核苷酸序列的第二引物，使用聚合酶链式反应，可从所述甜菜植株、其部分或其种子的基因组DNA中扩增 270-300bp的DNA片段，和/或e)采用含有SEQID NO :9核苷酸序列的第一引物和含有SEQ IDNO :10核苷酸序列的第二引物，使用聚合酶链式反应，可从所述甜菜植株、其部分或其种子的基因组DNA中扩增 710-790bp的DNA片段，和/或f)采用含有SEQID NO :14核苷酸序列的第一引物和含有SEQID N0:16核苷酸序列的第二引物，使用聚合酶链式反应，可从所述甜菜植株、其部分或其种子的基因组DNA中扩增 990-1 IOObp 的 DNA 片段，其特征在于，该方法包括将农杆菌-CP4-EPSPS-基因稳定地掺入植物基因组中，并且所述种子通过采用二元载体PV-BVGT08的农杆菌介导的转化技术进行制备，其中所述载体在左和右边界区之间包含下列序列编码区，其由来自拟南芥EPSPS的叶绿体转运肽编码序列(称为ctp2)组成，该编码序列与CP4-EPSPS编码序列结合，且处于玄参花叶病毒启动子(pFMV)和来自豌豆的E9-3’转录终止序列的调控下。
41.根据权利要求40的方法，其特征在于，在b)中，可从所述甜菜植株、其部分或其种子的基因组DNA中扩增664bp的DNA片段。
42.根据权利要求40的方法，其特征在于，在c)中，可从所述甜菜植株、其部分或其种子的基因组DNA中扩增3706bp的DNA片段。
43.根据权利要求40的方法，其特征在于，在d)中，可从所述甜菜植株、其部分或其种子的基因组DNA中扩增的DNA片段。
44.根据权利要求40的方法，其特征在于，在e)中，可从所述甜菜植株、其部分或其种子的基因组DNA中扩增751bp的DNA片段。
45.根据权利要求40的方法，其特征在于，在f)中，可从所述甜菜植株、其部分或其种子的基因组DNA中扩增1042bp的DNA片段。
全文摘要
本发明涉及草甘膦耐受性甜菜。本发明涉及草甘膦耐受性甜菜植株，植株材料和种子。本发明的目标是制备转基因甜菜植株的事件，所述甜菜植株具有对草甘膦的高度耐受性并且保持在生长，产量，品质和病原抗性等方面的其他重要农学性质。
文档编号C12N15/82GK102391988SQ20111007450
公开日2012年3月28日 申请日期2004年2月17日 优先权日2003年2月20日
发明者A·罗克, E·绍尔布雷, J·克劳斯, R·内尔斯, R·延森 申请人:Kws萨特股份公司