一种适合基因叠加的载体及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种适合基因叠加的载体及其应用。
【背景技术】
[0002]传统导入新基因到商业品种通常是通过经典育种的方法，产生一个纯合品系，该品系不仅要包括转基因，也包括大田品种的优良性状。二倍体植物中，在没有遗传连锁的情况下，通过分离获得η个独立性状的纯合株系的比例是(?)11。所以，如果要获得7个优良性状和I个转基因性状的纯合株系，需要16，000个单株以上才能获得，比例为以)7。如果有3个转基因位点，那么纯合株系的比例为(?)1(1，需要在超过1，000，000个单株中才有可能筛选到纯合株系。由于大量地区特异品种和当地大田性状的众多育种目标要求，增加分离的转基因位点将需要投入巨大财力和时间成本用于转基因的作物改良。
[0003]为了保持单个转基因位点，一些发明者将新的基因和已经导入基因组的基因在体外融合，构建新的转化载体，重新进行转化。这种方法可以通过筛选转基因完整插入的植物株系达到目的。这种“重做”的方式可以在导入性状较少的情况下考虑。但是商业品种如果已有多个转基因性状，当每增加一个新的性状，就使得这种做法因重新转化和需要再次获得政府批准变得更加困难。
[0004]一般来说，避免多个分离位点的措施之一就是直接转化优良品种。这个捷径对育种来说可以加速新转基因品种的研发。然而，大多数商业品种的遗传转化比较困难，需要投入巨大的财力物力才能获得足够数量的转化体用于大田试验。不同地区的差异带来大量不同的适应当地的品种，需要针对该品种研发有效的转化方法。从监管来看，转化同样DNA的每一个商业品种需要当做单个独立事件，逐个进行安全评价。这与单个转化事件通过育种措施导入大田品种有着明显的不同。可见，现有的技术中，获得多个基因叠加的转基因植株的工作量非常庞大，且概率低。
【发明内容】
[0005]为了解决上述存在的问题，本发明应用基因叠加手段，构建适用于基因叠加的载体，载体中含有用于基因叠加的目标位点，由aii/或者ai级序列组成,允许新的DNA分子通过重组酶Bxbl催化整合；并且确定了水稻染色体上适合整合新性状基因的基因组位点。本发明将相关基因通过位点特异性重组叠加在该基因位点处，不仅可以直接减少分离位点的数目，大大降低了将转基因从实验室品系导入大量的当地大田品种过程中的工作量。
[0006]本发明的目的在于提供一种适合基因叠加的载体。
[0007]本发明的另一目的在于提供一种适合水稻基因叠加的基因组位点。
[0008]本发明的再一目的在于提供一种产生用于水稻基因叠加的株系的方法。
[0009]本发明所采取的技术方案是:
一种适合基因叠加的载体，该载体含有DNA片段4，所述DNA片段4中含有DNA片段I和DNA片段2，以及JffiS重组位点或重组位点； 其中，所述DNA片段I含有aii/或aiiA重组位点，以及位于aii/或aiiA重组位点一侧的大肠杆菌噬菌体Pl中的重组位点；
所述DNA片段2含有所感兴趣的基因，以及位于该兴趣基因两侧的大肠杆菌噬菌体Pl中的重组位点，通过该2个重组位点的重组可以将所感兴趣的基因删去，该2个重组位点同向，且与片段I中的重组位点方向相反；
上述DNA片段I和片段2按任意顺序连接构成DNA片段3 ；
上述DNA片段3两侧连有能够删除该DNA片段3的JffiS重组位点或湩组位点；所述JffiS重组位点或湩组位点与DNA片段3构成所述的DNA片段4。
[0010]进一步的，上述JffiS重组位点为RK2或P4质粒中能被重组酶ParA识别的JffiS重组位点。
[0011 ] 进一步的,上述重组位点为Acetinetobacier质粒中能被重组酶CinH识别的重组位点。
[0012]进一步的，上述aii/或 aiii?重组位点为 Mycobacterium菌体 Bxbl中的aii/或aiii?重组位点。
[0013]进一步的,上述aii/或aiii?重组位点用于通过Bxbl整合酶将I个或多个目的基因DNA整合到该位点。
[0014]进一步的，上述所感兴趣的基因为筛选标记基因或/和报告基因。
[0015]进一步的，上述筛选标记基因选自潮霉素磷酸转移酶基因逆八新霉素磷酸转移酶基因m1、氯霉素乙酰转移酶基因CAT、PPT乙酰转移酶基因似兄5_烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶基因冲的至少一种。
[0016]进一步的，上述报告基因选自P-葡萄糖醛酸酶基因GttS;蓝绿色荧光蛋白基因CFA蓝色荧光蛋白基因说巧绿色荧光蛋白基因ffP，红色荧光蛋白基因似巧橙色荧光蛋白基因6F/7，黄色荧光蛋白基因17巧荧光素酶基因Zm中的至少一种。
[0017]一种真核细胞，该真核细胞中转化了上述所述的载体。
[0018]一种产生用于水稻基因叠加的株系的方法，将上述所述载体中的片段4通过农杆菌双元载体中的T-DNA序列整合到水稻基因组中，即可。
[0019]水稻基因组中适合上述水稻基因叠加载体插入的基因组位点，该基因组位点包括:
1)水稻染色体8的长臂第16，669，154位碱基和第16，669，159碱基位之间；
2)水稻染色体5的长臂第27，601,556位碱基和第27，601, 606位碱基之间；
3)水稻染色体I的短臂第9，639，408位碱基和第9，639，426位碱基之间；
4)水稻染色体2的短臂第5，187，205位碱基和第5，187，244位碱基之间；
5)水稻染色体5的长臂第27，877，812位碱基和第27，877，843位碱基之间；
6)水稻染色体I的长臂第32，100，641位碱基和第32，100，689位碱基之间；
7)水稻染色体I的长臂第35，913，934位碱基和第35，913，966位碱基之间；基因组信息参照水稻基因组数据库Os-Nipponbare-1RGSP-1.0。
[0020]本发明的有益效果是:
I)本发明包括在真核细胞基因组产生重组目标位点的载体构成元件和方法，可以在重组目标位点整合基因，DNA转化载体中的遗传元件用来目标位点的构建，并且获得了有利于水稻基因叠加的7个基因组位点。
[0021]2)本发明研发的植物体内基因叠加系统，可显著促进商业产品研发者能够将新的转基因叠加到现有的转基因位点；本发明公开的7个适合水稻基因叠加的基因组位点，有利于将相关基因通过位点特异性重组叠加在该基因位点处，不仅可以直接减少分离位点的数目，大大降低了将转基因从实验室品系导入大量的当地大田品种过程中的工作量，而且几乎不影响其他基因的正常表达。
[0022]3)本发明的7个适合基因叠加的水稻基因组位点位于基因组中已知编码基因的上游Ikb之外或者下游0.5kb之外，不会导致水稻内源基因功能的丧失；且对本发明获得的7株目标株系的T2株系的报告基因进行表达分析，其能够高效表达，说明在本发明的7个基因组位点处可以闻效表达目的基因。
【附图说明】
[0023]图1为载体pZH37的具体构建流程；A为重组载体pZHll匪的构建过程，B为重组载体pZH35匪的构建过程，C为重组载体pZH37的构建过程；
图2为构建好的载体pZH36和pZH37的简要结构示意图；包括的基因有如?，潮霉素磷酸转移酶基因\gUS, β 一葡萄糖醒酸酶；讲5基因由左向右转录，基因由右向左转录，字母方向同转录方向；启动子和终止子没标识；讲5基因启动子为水稻actin2启动子和ubiquitinl终止子；如(基因启动子为actinl启动子和CaMV 35s终止子山和R代表T-DNA的左边界LB和右边界RB，载体经SacI酶切后的片段大小示意图由蓝色字母标识；pZH36载体下方的长方向框代表gus和hpt DNA探针；
图3为部分株系(株系281，367，766，131，284，325和537)的基因组与如?探针和gus探针的杂交图谱，A为与探针的杂交图谱，B为与讲5探针的杂交图谱；ΖΗ11表示野生型水稻中华11 ；
图4为本发明获得的7个转基因株系的⑶S染色检测图，其中，281，367，766，131，284，325和537为7个转基因株系，ZHll表示野生型水稻中花11 ；
图5本发明7个株系中T-DNA在基因组的定位,水稻基因组图谱来自www.ricemap.com,空心蓝圆圈表示载体为pZH36，实心红色圆圈表示载体为pZH37 ；
图6为目标株系基因组插入位点侧翼序列；图中染色体的位置数目来自水稻基因组注释项目(The Rice Annotat1n Project, http://rapdb.dna.affrc.g0.jp/);由于载体的方向如图1A所示从左边界到右边界，所以染色体的位置数字可能增加，也可能减少；字母上方带有*的部分是T-DNA整合后基因组缺失的部分；下划线的代表小写字母代表该序列不是来源于插入位点或者载体；加粗大写字母代表T-DNA左边界LB ；7个目标株系整合到染色体部分均未包括右边界RB ;小写字母表示与载体PZH36或pZH37载体一致的序列；长方向框中小写斜体字母代表与重组位点RS2 —致的序列；
图7为载体PZH36产生的目标位点:DNA序列从T-DNA的左边界或右边界到最里的1x位点处；加粗大写字母代表T-DNA左边界LB或右边界RB ; 7个目标株系均不包括T-DNA右边界RB ;小写字母代表与载体PZH36 —致的序列；框格内小写斜体字母代表的是与标注重组位点MRS或者1x—致的序列；载体右边界包括大肠杆菌IacZ alpha部分编码区片段(其为pCambia载体的一部分，转化植株中整合有部分载体骨架)； 图8为载体pZH37产生的目标位点:DNA序列从T-DNA的左边界或右边界到最里的1x位点处；加粗大写字母代表T-DNA左边界LB或右边界RB ; 7个目标株系均不包括T-DNA右边界RB ;小写字母代表与载体PZH37 —致的序列；框格内小写斜体字母代表的是与标注重组位点MRS或者1x —致的序列；载体右边界包括大肠杆菌IacZ alpha部分编码区片段(其为pCambia载体的一部分，转化植株中整合有部分载体骨架)。
【具体实施方式】
[0024]下面对结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
[0025]实施例1适合基因叠加的载体
载体构建应用常规的重组DNA方法。所有的PCR反应采用高保真Phus1nHigh-Fidelity DNA Polymerase (NEB北京，中国)。本实施例以水稻为例，说明一种适合水稻基因叠加的载体的构建过程，适合其他生物基因叠加的载体可以按照该方法进行类似的构建，如载体中的启动子序列、筛选基因等根据目标生物的特性进行选择。
[0026]一、适合水稻基因叠加的PZH37载体的构建
PZH37载体的构建流程如图1所示，结合图1对其构建的具体方法进行如下的描述:
1)重组载体PZH2的构建
构建pZH37的骨架载体来自于pCambia系列的载体pC13Bar (来自Ow lab)。通过PCR的方法将AscI和分el限制性内切酶位点放入骨架载体用于后续的DNA克隆。具体操作为:以 pC13Bar 为模板，用引物 5，-cggtgatcacaggcagcaacgctctgtcat-3’ (SEQ ID NO:1)和 5，-atatgcatactagtggcgcgccttaattcagtacattaaaaacgt-S，(SEQ ID N0:2)扩增获得330bp片段，经Bcll和Nsil酶切，利用琼脂糖凝胶纯化；同时用Bcll和Pstl酶切pC13Bar，纯化大片段；将纯化后的这两个片段用T4 DNA连接酶连接得到重组载体pZH2(如图 1A)；
2)重组载体p