β-扩张蛋白基因GmEXPB2的新应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因的新应用，具体涉及0 -扩张蛋白基因GmEXPB2在提高豆科植物 氮效率方面的新应用，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 大豆[Glycine max(L. )Merr]起源于中国，是世界范围内重要的粮食、油料、饲 料和能源作物，在人们生活食品结构中占有重要地位（Palander et al.，2005)。近年 来，随着大豆消费的增长以及养殖业的飞速发展，国内大豆供求出现严重失衡，我国大豆 生产和需求间的矛盾日益突出。2000年起，我国就已从传统的大豆出口国变成现今世界 上最大的进口国（杨文钰等2008)。最新数据显示，2013年我国大豆进口量达6338万 吨，同比增加8. 6 %，创记录高位（中国粮油信息网，http: //www. chinagrain. cn/dad ou/2014/1/13/201411313313124408. shtml)。因此，为满足国内对大豆消费的需要，我国有 必要大力发展大豆产业，解决大豆供需矛盾，以减少对大豆进口的依赖。
[0003]我国大豆生产水平较低，究其原因主要是土壤养分有效性较低，例如土壤缺氮，是 限制大豆生产的主要因素之一。在长期的进化过程中，植物形成了一系列适应低氮胁迫的 作用机制。其中，结瘤固氮是提高豆科作物氮效率的重要途径。根瘤菌侵染豆科植物根系所 建立的共生体系，对农业生产及生态环境的可持续发展具有重要意义。研究表明，接种根瘤 菌可提高豆科作物的固氮能力，改善氮营养，促进根系生长和提高作物产量（Ferreira et al.，2009)。在美国、巴西等大豆主产国，接种根瘤菌已成为大豆增产的主要措施之一，已大 面积推广和应用。而我国将根瘤菌接种技术应用于农业生产，也取得了良好的效益（汤复 跃等2011 ;Mendes et al.，2003 ;Sogut 2006 ;de Freitas et al.，2012)。
[0004]根瘤的形成及器官膨大与细胞壁的形态建成密切相关，扩张蛋白（Expansin)是 一类细胞壁松弛蛋白，在诱导细胞壁增大和软化、根瘤生长发育等方面扮演重要角色。
[0005]然而，关于扩张蛋白在调控豆科作物结瘤固氮方面的研究非常有限，并且在大豆 中，调控根瘤形成和发育的扩张蛋白基因尚未见报道。
【发明内容】
[0006]基于上述研究背景，发明人通过定量PCR及化学组织定位方法，鉴定了一个在大 豆根瘤形成早期高度表达的扩张蛋白基因GmEXPB2。该基因参与调控了根瘤原基、皮层 细胞、薄壁细胞及早期根瘤微管组织的发育。
[0007]利用大豆转基因复合植株及整株转化植株研究表明，过量表达GmEXPB2显著增加 了大豆根瘤数量和重量、提高了植株氮含量，最终增加了转基因植株的生物量。
[0008]发明人的研究将为包括大豆在内的豆科作物氮高效和高产分子育种提供基因资 源。
[0009]本发明的有益之处在于：此项研究对增加包括大豆在内的豆科作物根瘤数量和重 量、提高植株氮含量、增加转基因植株的生物量具有重要意义，对发展环境友好型可持续农 业也具有重要的实践意义，同时也为高产分子育种提供了基因资源。
【附图说明】
[0010] 图1为GmEXPB2基因表达模式分析；
[0011] 图2为大豆转基因复合植株中GmEXPB2启动子驱动⑶S表达部位的解剖分析；
[0012] 图3为过量、干涉GmEXPB2对大豆转基因复合植株结瘤的影响；
[0013] 图4为过量、干涉GmEXPB2在高低磷处理下对大豆转基因复合植株生长和氮/磷 含量的影响；
[0014] 图5为过量表达GmEXPB2对大豆转基因植株根系形态的影响；
[0015] 图6为过量表达GmEXPB2的转基因大豆接种根瘤菌USDA110-GFP的侵染过程；
[0016] 图7为高、低磷处理下过量表达GmEXPB2对大豆结瘤的影响；
[0017] 图8为过量表达GmEXPB2对大豆生长及氮/磷含量的影响。
【具体实施方式】
[0018] 以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
[0019] 一、3 -扩张蛋白基因GmEXPB2表达模式分析
[0020] 在已公布的大豆基因组数据库中，通过同源比对，预测出大豆扩张蛋白家族 共有9个成员，通过定量PCR技术，确定GmEXPB2基因为根瘤增强表达的基因。GmEXPB2基 因的开放阅读框长度为834bp，编码278个氨基酸的蛋白，属于0类细胞壁扩张蛋白。现有 的研究表明，该基因与结瘤固氮密切相关，首先分析了其表达模式。
[0021] 大豆种子HN66用3% (v/v)H202表面消毒一分钟，在1/2全营养液润湿的石英砂中 催芽萌发5天，接种根瘤菌1小时后转移到低氮（氮素：530iiM NH4N03+KN03+Ca(N03) 2 *4H20) 营养液中处理。分别收获处理第7天的根瘤，第18天的根、茎、叶、花及处理第29天的豆荚 和种子并抽提RNA。对于比较分析GmEXPB2在不同生长时期根瘤中的表达量，收获接种根瘤 菌后第4天的根系、第7、14、21、30、40天的根瘤及非接种根瘤菌的第7天根系，并抽取相应 部位的RNA，反转录成cDNA，进一步用定量PCR检测GmEXPB2的表达模式。大豆的看家基因 EF-la作为内参。用于定量PCR检测基因表达量的引物分别为：
[0022] 大豆EF-la基因的引物为：
[0023] EF-la F:5, -TGCAAAGGAGGCTGCTAACT-3'（SEQ ID N0:1)
[0024] EF-la R:5, -CAGCATCACCGTTCTTCAAA-3'（SEQ ID N0:2)
[0025] GmEXPB2基因的引物为：
[0026] GmEXPB2F:5,-TGGTGCTTGTGGTTATGGAAGT-3'（SEQ ID N0:3)
[0027] GmEXPB2R:5'-TGAACCACACCCAGGACAGCT-3'（SEQ ID N0:4)
[0028] 定量PCR反应程序为：将RNA样品反转录所得cDNA稀释50倍作为定量PCR反应 模板。选取适量cDNA原液做梯度稀释为标准曲线的模板。试验中采用20 yL反应体系，包 括：10yL 的 2XSYBR Green PCR master mix，各 0.6iiL 的 10iiM 正反向引物，2iiL 稀释 的cDNA，最后用Mili-Q水补至20ii L。
[0029] 定量PCR反应条件为：95°C变性1分钟，然后94°C裂解15秒，60°C结合15秒，72°C 延伸30秒并进行40次循环。
[0030] 用 Rotor-Gene 的 Real-Time Analysis Software 6. 0 计算每个样品的表达量。
[0031] 图1为GmEXPB2基因表达模式分析。其中：
[0032] 图1⑷为GmEXPB2在不同组织中的表达；
[0033] 图1 (B)为GmEXPB2在不同发育时期根瘤中的表达。
[0034] 图中数据是3个生物学重复的平均值和标准误差。
[0035] 结果表明：
[0036] (l)GmEXPB2在根瘤中的表达量最高，根部次之，在豆荚中亦存在微量表达，但在 茎、叶、花和种子中检测不到该基因mRNA的积累，参见图1 (A)。
[0037] (2)对不同发育时期的根瘤进行qRT-PCR检测分析，发现GmEXPB2在接种4天后 的根系中增强表达，当根瘤生长到第7天时表达量达到最大值，但随着根瘤的生长时间的 延长，其表达量逐渐降低，当根瘤生长到30和40天时，几乎检测不到该基因的