扁蓿豆脱水蛋白基因及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物基因工程技术领域，尤其设及扁猜豆脱水蛋白基因及其应用。
【背景技术】
[0002] 脱水蛋白属于晚期胚胎发生丰富蛋白（lateembiTogenesis油undantprotein) LEAII家族。脱水蛋白最初在种子中发现，随后的研究表明脱水蛋白广泛分布于藻类、酵 母、线虫、蓝细菌W及高等植物的各个组织和器官中。干旱、低溫和高盐等引起脱水的环境 因素W及脱落酸（ABA)均能诱导其在细胞中的表达。脱水蛋白含有至少一个保守的富含赖 氨酸的基序K-片段巧KKGIMDKIKEKLPG或其衍生物），它们常形成双亲性(亲水亲脂）的螺 旋结构。有些脱水蛋白通常还包含Y-片段和S-片段，Y-片段通常W1-3个重复形式灯/ VDEYGNP)出现在脱水蛋白的N-端，S片段由一系列丝氨酸（Ser)残基组成。基于Y，S，K片 段出现的类型和数量可将脱水蛋白分为5个亚家族：化SKn,SKn,Kn,化Kn和KnS。
[0003] 脱水蛋白在细胞内的功能与细胞脱水保护有关。通过转基因技术，将大麦脱水蛋 白基因ZmDHN化转入烟草，转基因植株的抗低溫能力提高；拟南芥中超表达小麦DHN-5基因 可W增强其对盐和渗透胁迫的抗性；小麦脱水蛋白基因WC0R410过表达能够增强草替的抗 冻性。因此，脱水蛋白可能是包括植物、细菌W及低等动物细胞获得脱水耐受性的决定性因 素之一，尽管其具体的机制尚不清楚。同时，脱水蛋白基因也在植物干旱、低溫、高盐等非生 物胁迫抗性改良中具有重要的潜在应用价值。
[0004] 除了植物遗传转化试验W外，大肠杆菌和酵母等异源表达系统也被广泛用于脱水 蛋白的鉴定。过表达大豆LEA3家族中的一个PM2蛋白和KS型脱水蛋白SLT1629能够明显 提高到大肠杆菌可提高大肠杆菌抗盐能力；将大麦脱水蛋白引入酵母后可W使其获得对高 盐胁迫的耐受性。因此，利用酵母、大肠杆菌表达系统可W作为鉴定脱水蛋白的有效体系。
[0005] 扁猜豆ife扣Ca洗rutAenica任J广泛分布于西伯利亚，蒙古和我国的北方高缔 度高寒地区，多生长于山坡草地处，对逆境具有极强的耐受性，是唯一能够在高海拔极端高 寒地区正常越冬的首猜属多年生豆科牧草。目前只有零星扁猜豆脱水蛋白基因克隆的报 道，但尚无对其抗逆功能鉴定的报道。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是提供一种改良植物和微生物抗盐及耐热性的扁猜 豆脱水蛋白基因。
[0007] 本发明所要解决的另一个技术问题是提供该基因在改良植物和微生物抗盐及耐 热方面的应用。
[0008] 为解决上述问题，本发明所述的扁猜豆脱水蛋白基因，其特征在于：该基因为 必'化^满§码基因，它具有序列表中SEQIDNO. 1第1位到890位所示的核巧酸序列。
[0009] 所述基因具有序列表中SEQIDNO. 1第1位到890位中因一个或多个碱基的缺失、 插入或替换而形成的具有功能活性的等位基因。
[0010] 所述基因具有序列表中SEQIDNO. 2第I位到221位所示的氨基酸残基序列的蛋 白质。
[0011] 所述基因具有序列表中SEQIDNO. 2第1位到221位所示的氨基酸残基序列经一 个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加但含1个一系列丝氨酸（Ser)残基的S-片段和2 个富含赖氨酸残基的K-片段（EKKGIMDKIKEKLPG或其衍生物）且具有与SEQIDNO. 2氨基 酸残基序列相同活性的由SEQIDNO. 2衍生的蛋白质；所述由SEQIDNO. 2衍生的蛋白质 的序列与等位基因的序列相对应。
[0012] 如上所述的扁猜豆脱水蛋白基因在改良植物和微生物抗盐及耐热方面的应用。
[0013] 本发明与现有技术相比具有W下优点： 1、本发明通过转录组学分析，结合RT-PCR技术，在扁猜豆中分离到一个新的脱水蛋白 基因i/rWWJ。将i/r化Wt?基因编码区连接到大肠杆菌表达载体后，将该原核表达载体转入 大肠杆菌表达菌株，用IPTG诱导实现了化畑N3蛋白在大肠杆菌中的过量表达，结果显示， 化畑N3蛋白过量表达对高盐和热胁迫下的大肠杆菌具有保护效果，因此，通过生物技术方 法可将该基因用于植物和微生物的抗盐和耐热性改良。
[0014] 2、通过对本发明中的扁猜豆脱水蛋白基因进行RT-PCR扩增后，进行琼脂糖凝胶 电泳巧日图1，图5~8所示)，可W检测到约9(K)bp的扩增产物。
[0015] 3、通过将本发明中的扁猜豆脱水蛋白i/r化W?基因的编码区连接到大肠杆菌表达 载体，经过酶切鉴定后（如图9所示），转化大肠杆菌表达载体，含有如上述构建的i/r化W? 基因的原核表达载体的大肠杆菌中经IPTG诱导，对培养物菌体总蛋白进行SDS-PAGE电泳， 结果显示诱导后的大肠杆菌培养物中具有一条与预期分子量相近的蛋白条带巧日图10所 示)，因此扁猜豆脱水蛋白化畑N3能够在大肠杆菌中过量表达。
[0016] 4、通过对过量表达本发明中的扁猜豆脱水蛋白化畑N3的大肠杆菌经热胁迫处理 和在含高盐培养基上培养后，观察如上所述大肠杆菌的生长存活情况，结果显示化畑N3蛋 白过量表达能够提高大肠杆菌宿主对高盐胁迫和热胁迫处理的耐受性（如图11~12所示）， 因此化DHN3蛋白在高盐胁迫和热胁迫处理下对细胞具有保护效果。
[0017]5、本发明的基因结构特征： 本发明根据对扁猜豆转录组测序结果，设计PCR引物，其中引物P1+P2用于扩增含有 5'-和3'-非翻译区和编码区的i/r化W?基因序列（图1~2)。引物P3+P4扩增i/r化W?基因 编码区核巧酸序列，用于原核表达鉴定克隆基因的功能活性。
[001引用引物P1+P2,扁猜豆CDNA为模板进行扩增，得到约9(K)bp的条带（图1)。测序后 获得89化P巧日图2)如序列表SEQIDNO. 1所示的含有5'-和3'-非翻译区和编码区的 i/r化W?基因序列，其中173-839位为翻译区。由SEQIDNO. 1序列推导出的氨基酸序列如图 2(S片段用下划线标出，2个保守的K片段用阴影标出)和序列表SEQIDNO. 2所示。该氨基 酸序列显示，蛋白质产物由221个氨基酸残基组成，预测分子量（Mw)为24.84kD，理论等 电点（pi)为5. 56,为酸性蛋白。总平均疏水性指数Grandaverageofhy化opathicity (GRAVY)为-I. 444,具有较高的亲水性。在Pfam数据库化ttp://pfam.janelia.org)数 据库对化DHN3编码的氨基酸序列的结构域进行捜索表明，化DHN3蛋白属于LEAII蛋白家 族，存在一个S-片段(实线框标出)和2个富含赖氨酸残基的K-片段(虚线框标出）（图3)， 为SK2型脱水蛋白。在NCBI数据库中利用BLAST对化DHN3编码蛋白质的氨基酸序列和其 它物种蛋白质氨基酸序列比较（图3)发现与裝襲首猜（Medicagotruncatula)和白S叶(Trifoliumrepens)氨基酸序列一致性（identity)最高，达81%W上。对NCBI下载的6 个物种的SKn型脱水蛋白氨基酸序列构建系统进化树（图4)发现，化DHN3与豆科植物魏豆 SK2蛋白的萊缘关系最近。
【附图说明】
[0019] 下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细的说明。
[0020] 图1为本发明扁猜豆脱水蛋白基因i/r化W撕RT-PCR克隆产物电泳图谱。
[0021] 图2为本发明i/r化W?基因CDNA序列及其所编码蛋白质的氨基酸序列。
[0022] 图3为本发明扁猜豆脱水蛋白化畑N3和其它物种脱水蛋白氨基酸序 列的比对分析。其中TrDHNS(ADD09573. 1)来自白S叶灯rifoliumr巧ens); Mt畑N3〇(P_003603987. 1)来自裝襲首猜（Medicagotruncatula) ;Ps畑N3(CAA78515. 1)来 自魏豆（Pisumsativum) ;CaDHN3(XP_004500781. 1)来自鹰嘴豆（Cicerarietinum)。1个 实线框示保守的S-片段，2个虚线框为保守的富含赖氨酸残基的K-片段。
[0023] 图4为本发明扁猜豆脱水蛋白化DHN3和其它物种SKn型脱水蛋白构建的系 统进化树。其中 0sDHN3(ABS44866. 1)来自梗稻（OryzasativaJaponicaGroup)