; TaDHN3(AAB18202.I)来自小麦灯riti州maestivum) ;MaDHN3(AEI54683.I)来自 大蕉（MusaABBGroup) ;CsDHN3 (ACT10283.1)来自茶（Camelliasinensis); PpDHN3(AAZ83586.I)来自桃（Primuspersica) ;PsDHN3(AAL50315.I)来自魏豆（Pisum sativum)。实屯、S角符号指示扁猜豆脱水蛋白化DHN3。
[0024] 图5为本发明扁猜豆脱水蛋白i/r化W?基因在模拟脱水胁迫处理下基因表达水平 的半定量RT-PCR分析，为用于内标的扁猜豆肌动蛋白基因。
[002引图6为本发明扁猜豆脱水蛋白i/r化W?基因在化Cl胁迫处理下基因表达水平的半 定量RT-PCR分析，为用于内标的扁猜豆肌动蛋白基因。
[0026] 图7为本发明扁猜豆脱水蛋白i/r化W?基因在ABA处理下基因表达水平的半定量 RT-PCR分析，心。打为用于内标的扁猜豆肌动蛋白基因。
[0027] 图8为本发明扁猜豆脱水蛋白i/r化W?基因在低溫处理下基因表达水平的半定量 RT-PCR分析，心。打为用于内标的扁猜豆肌动蛋白基因。
[0028] 图9为本发明扁猜豆脱水蛋白i/r化W撕原核表达载体祀T30a-化DHN3的酶切鉴 定电泳图谱。其中"BamHI+SacI"为BamHI和SacI双酶切消化处理的祀T30a-化DHN3 载体，"BamHI"为BamHI单酶切消化处理的祀T30a-MrDHNS载体，"SacI"为SacI单 酶切消化处理的祀T30a-化畑N3载体，"Plasmid"为未做酶切消化处理的祀T30a-化畑N3 载体。
[0029] 图10为本发明扁猜豆脱水蛋白化DHN3在大肠杆菌化2UDE3)中诱导表达的 SDS-PAGE电泳鉴定。其中"1"为IPTG诱导前的总蛋白，"2"为IPTG诱导后的总蛋白/'3" 为上清液中诱导表达的蛋白，"4"为上清液经100 °C处理10min后可溶性蛋白。
[0030] 图11为本发明扁猜豆脱水蛋白化DHN3在大肠杆菌中表达后对宿主菌的逆境胁迫 保护效果的菌液滴板试验。其中化/pET30a为含有祀T30a(+)质粒的化2UDE3)大肠杆菌； 化/Mrf)HN3为含有祀T30a-Mrf)HN3质粒的化21值E3)大肠杆菌；LB为Luria-Bertani(LB) 固体培养基添加有0. 5mmol/LIPTG;LB+ 500ml化Cl为LB固体培养基添加0. 5mmol/L IPTG和 0. 5mol/L化Cl;LB+500mlKCl为LB固体培养基添加 0. 5mmol/LIPTG和 0. 5 mol/LKCl;LB巧5 °C，30min)为 55 °C热处理 30min。
[0031] 图12为本发明扁猜豆脱水蛋白化畑N3在大肠杆菌中表达后对宿主菌的逆境胁迫 保护效果的菌落计数统计结果。其中化/pET30a为含有祀T30a(+)质粒的化2UDE3)大肠 杆菌；BL/Mr畑N3为含有祀T30a-Mrf)HN3质粒的BL21 〇)E3)大肠杆菌成aCl(0. 5M)和KCl (0. 5M)为高盐胁迫、化at为（55°C，热胁迫处理30min。
【具体实施方式】
[0032] 实施例1扁猜豆脱水蛋白基因，该基因为i/r化编码基因，它具有序列表中SEQ ID NO. 1第1位到890位所示的核巧酸序列。
[0033] 一、扁猜豆脱水蛋白i/r化Wt?基因的克隆。
[0034] 1、扁猜豆幼苗低溫胁迫处理与转录组测序： 山扁猜豆低溫胁迫处理： 将扁猜豆种子用浓硫酸处理IOmin后，用蒸馈水冲洗数次去除残余硫酸。上述经过处 理的种子置于铺有双层滤纸培养皿内，在2rC、1化/化光周期条件下发芽；3d后将发芽的 幼苗移栽于赔石：营养±(3:1)的混合基质中继续在上述条件下培养，每周用含1/2MS营养 液诱灌一次；3周W后将幼苗转移至-4°C光照培养箱进行低溫处理2地，在低溫处理前和处 理后，取整株幼苗，清洗干净根部，用吸水纸吸净剩余水分后液氮速冻，-80°C保存。
[003引似转录组测序： 将低溫处理前和处理后的幼苗，送深圳华大基因科技服务有限公司进行总RNA提取和 转录组测序。
[0036] 2、引物设计： 根据转录组测序结果设计PCR引物，具体如下： Pl5' -CGTGTCATTATGTGTAGTAGTGAAG-3' P2 5' -TAAACAAAGCACCCTCCA-3' 3、总RNA提取与CDNA第一链合成： 将上述低溫胁迫处理的样品在液氮中研磨成粉末后，用Trizol试剂（Invitrogen公司 产品）按照其说明书提取总RNA。总RNA用20yLDEPC处理的水溶解，调整浓度为50化g/ JiL。
[0037] cDNA第一链合成反应使用PrimeScript? RT reagent Kit (Perfect Real Time) (Takara产品）试剂盒按照其说明书进行。
[0038]4、i/r化W?基因cDNA序列扩增： PCR反应体系由IOyL2XPCRBufferI、1.6yLdNTP、0.4yLPl(lOyM)、 0. 4iiLP2 (l〇yM)、0. 05yLLA?TaqDNA聚合酶巧U/yL)(Takara产品）、0. 05yL Pyrobest?DNA聚合酶巧U/yL) (Takara产品）、IyLcDNA第一链合成产物组成，加d地2〇 (双蒸水）至终体积为20yL。
[0039] 其中：2XPCRBufferI为与LA"TaqDNA聚合酶配套缓冲液。
[0040]dNTP由dATP(=憐酸腺嚷岭脱氧核巧酸)、dTTP(脱氧胸巧=憐酸)、dGTP(脱氧鸟 巧S憐酸S钢）和dCTP(脱氧胞巧S憐酸）组成；dATP、dTTP、dGTP和dCTP均为2. 5mM。
[0041] PCR反应体系按下列程序进行： tft：； 索麵抖 獅管：賴:留 平： -雜粒 ，纖： ^ 誠韦龜賴 '~2V- 1iiuijJOs .............. 一： -ir 10mm 反应结束后，用0. 7%的琼脂糖凝胶检测PCR产物，得到如图I所示的约9(K)bp的条带。
[0042] 5、PCR产物回收： PCR产物用UNIQ-IO柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工产品）回收。
[004引 6、目的DNA片段的克隆： 连接体系： 山连接体系总量为5yL由0. 5yLpGE]\f-TEasy载体（Promega产品）、0. 5yLTa DNA连接酶、2. 5yL2XRapid连接缓冲液和1. 5yL目的DNA片段组成。其中连接酶和连 接缓冲液为pGEM-TEasy载体自带。
[0044] 似将5yL连接体系在4°C下连接过夜。
[004引樹将5yL连接体系全部加入至50yL大肠杆菌D册a感受态细胞中，混匀后，冰 浴 30min。
[0046] (4)将步骤樹所得的混合体系在42°C水浴中热激90s后，立刻置于冰浴中2min。
[0047] 脚在步骤(4)所得的混合体系中加入400yLLB液体培养基，于37°C下W16化pm的 速率振荡Ih，得到活化后的D册a菌液。
[0048] 做取 200yL活化后的D册a菌液，和 5yLIPTG(IM)与 40uLx-gal(20mg/ml)混 合，在含有氨节青霉素（Amp)(100yg/ml)的LB平板培养基上涂板，于37°C下培养12~I化。
[0049] 7.阳性克隆的鉴定与测序： (1)用牙签挑取LB平板培养基上长出的白色抗氨节青霉素阳性菌落，于另一含有Amp(100yg/ml)的LB平板培养基上划线培养8~1地，得到单菌落。
[0050] 似用牙签挑取画线培养的单菌落，涂于PCR管的底部。
[005。 口）PCR反应体系： PCR反应体系由 1.6yLdNTP、2yLIOXPCRBuffer、0. 4yLPl(10yM)、0. 4yLP2 (10yM)、0.IyL化9?酶（Takara产品）组成，并用d地20加至终体积为20yL。
[0052] 其中：10XPCRBuffer为hq?DNA聚合酶配套缓冲液。
[0053] dNTP由dATP、dTTP、dGTP和dCTP组成；dATP、dTTP、dGTP和dCTP均为 2. 5mM。
[0054] PCR反应体