一种提早成花时间基因LcVRN2及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种提早成花基因，具体涉及一种从荔枝中分离得到的提早成花时间基因LcVRN2及其应用，属于生物基因技术领域。
【背景技术】
[0002]蒸枝(Litchichinensis Sonn.)属无患子科(Sapindaceae)蒸枝属(Litchi)常绿乔木，其果实色、香、味倶佳，素有“果中之王”的美称。荔枝是我国南方亚热带地区广泛栽培的特产果树，主要分布在广东、广西、福建、海南、台湾、云南、四川、贵州等省(自治区)，果实不仅畅销全国，还出口到东南亚、欧美等国家和地区。我国是荔枝的原产地，栽培历史悠久，种质资源丰富，品种繁多，是世界第一荔枝生产国，面积和产量分别约占全世界的80%和65%以上。由于荔枝品质优异、风味独特和经济价值较高，是我国具国际市场竞争力和出口前景的特色果品之一。
[0003]通常情况下，荔枝末次梢老熟后，需要经过一定时间的低温诱导，才能正常成花。在冬季荔枝成花诱导期，如果末次梢老熟过早或遭遇高温潮湿天气，容易发生“冲梢”现象，如果处理不及时或方法不得当将会直接影响到荔枝来年的成花及产量。因此，研究荔枝成花机理，了解荔枝低温的响应机制将对解决荔枝成花不稳定等问题具有十分重要的意义。
[0004]春化作用主要通过重组FLC染色质来降低其表达量，这一过程需要VIN3，VRNl和VRN2等基因共同完成。VRN2编码一个核定位的锌指蛋白，是一种转录因子。VRN2是开花抑制因子，编码一个含锌指结构域的蛋白，其主要的功能是抑制VRNl的表达，该基因受春化作用的抑制，与拟南芥的FLC调控开花机理相似。在冬小麦中则可能是一些未知的因子获得低温信号，降低开花抑制因子VRN2的表达，导致下游VRNl等开花促进因子的开启，最终促进开花。荔枝对于外界环境的响应不同于草本植物的拟南芥和冬小麦，有关低温诱导荔枝开花的调控机制和分子机理仍然不清楚。
[0005]随着对拟南芥等模式植物成花机理的深入研究，了解荔枝成花的分子机理可有助于荔枝成花调控技术的改进和新品种改良。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种从荔枝分离出来的成花调节基因LcVRN2，并提供该基因的核苷酸序列及编码的氨基酸序列、定位及其在荔枝各组织中的时空分布特征，该基因具有提早植物开花的功能，可为荔枝栽培设施改进和利用基因工程来选育荔枝新品种提供借鉴。
[0007]本发明的另一个目的在于提供上述一种成花调节基因LcVRN2基因的应用。
[0008]本发明技术方案如下:一种从荔枝中分离得到的成花调节基因LcVRN2基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，该序列中的起始的ATG和末端的TGA分别为LcVRN2核苷酸序列的起始密码子和终止密码子；其最大开放式阅读框长度为1272 bp，编码424个氨基酸。
[0009]所述LcVRN2基因编码的氨基酸序列，如SEQ ID N0.2所示。
[0010]所述LcVRN2基因与苹果(MalusXdomestica)的编码氨基酸同源性为67.22%，与甘蓝(Brassica oleracea)的编码氨基酸同源性为51.18%，与拟南芥(Arabidopsisthaliana)的编码氨基酸同源性为50.71%。
[0011]所述LcVRN2基因定位在细胞核中。
[0012]所述L c V RN 2基因在荔枝成熟叶片、幼叶、叶芽、花芽、花穗和韧皮部中均有表达，其表达量顺序依次为:2月份的成熟叶片>10月份的幼叶>2月份的幼叶>10月份的成熟叶片〉叶芽〉花穗 > 花芽 > 韧皮部。
[0013]在叶片中，所述LcVRN2基因的表达量在低温诱导2周后开始迅速增加，低温诱导4周时达到较高值，并一直维持在一个较高水平直至开花；在顶芽中，LcVRN2基因的表达量一直维持在较低水平。
[0014]在15°C条件下处理叶片时，所述LcVRN2基因在叶片中的表达量在低温诱导3周后达到最高水平，然后逐渐下降；25°C条件下处理叶片时，所述LcVRN2基因在叶片中的表达量一直维持在较低水平。
[0015]本发明所述的从荔枝中分离得到的成花调节基因LcVRN2其应用于提早植物的开花时间，尤其是在提早转基因植物的开花时间方面的应用。
[0016]所述的转基因植物优选为转入LcVRN2基因的植物，更优选为转入LcVRN2基因的拟南芥，将LcVRN2基因与载体正向相连后得到重组质粒，将得到的重组质粒转化农杆菌，经花粉管通道法转化拟南芥后，促使拟南芥平均提前9天现蕾。
[0017]具体的，所述的转入LcVRN2基因，优选为通过将LcVRN2连接到pBI121载体上，获得重组质粒，将重组质粒转化农杆菌感受态细胞，完成转入LcVRN2基因。
[0018]本发明首次对LcVRN2基因的结构域特征、时空表达特征、在细胞中的分布情况及在拟南芥中的功能进行了分析，从LcVRN2的氨基酸结构上分析，LcVRN2可能具有提早荔枝成花时间的功能，通过转化拟南芥证实LcVRN2具有提早植物成花时间的功能，本发明技术对以后栽培设施改进和利用基因工程来选育荔枝新品种具有十分重要的意义。
【附图说明】
[0019]图1为设计引物克隆出的LcVRN2基因条带。
[0020]图2为LcVRN2基因编码的氨基酸序列比对及同源性分析，其中，A为LcVRN2推导蛋白质的序列分析，B为LcVRN2与其他物种中VRN2基因的进化分析。
[0021]图3为LcVRN2基因的时空分布特征，分别是LcVRN2基因在荔枝不同组织(A)、成花过程(B)及低温处理(C)的表达情况，A中，成熟叶I (当年10月份成熟叶片)、成熟叶2(次年2月份成熟叶片)、幼叶I (当年10月份幼叶)、幼叶2 (次年2月份幼叶)。
[0022]图4为LcVRN2基因在细胞中的分布定位，其中；第一列为荧光图片，第二列为第一列相对应的明视野，第三列为第一列与第二列的merge ;A:pBI121_GFP空载体；B:pBI121-LcVRN2-GFP。
[0023]图5为拟南芥中超表达LcVRN2基因。
【具体实施方式】
[0024]下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0025]本发明所提供的VRN2同源基因，从荔枝中分离克隆得到，命名为LcVRN2基因，其核酸序列如SEQ ID N0.1 (序列I)所示。
[0026]LcVRN2基因编码的氨基酸序列，命名为LcVRN2蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDN0.2 (序列2)所示。
[0027]一、成花调控基因LcVRN2基因的克隆及其序列分析上述LcVRN2基因的克隆方法及其序列分析，包括如下步骤。
[0028]1、实验材料选取所取实验材料分别来自田间和温室栽培“妃子笑”荔枝。不同部位材料取自田间种植“妃子笑”荔枝10月份成熟叶片和幼叶、次年2月份成熟叶片和幼叶、叶芽、花芽、花穗及枝梢韧皮部；成花过程样品取自末次梢老熟时(10月份)的成熟叶片和顶芽，每隔一周采一次叶片和顶芽，直至荔枝抽出花穗；温室处理样品取自末次梢老熟的成熟叶片(10月20日)，然后放入温室，一种室温25°C处理、一种室温15°C处理9周，然后转入25°C温室处理，每3周采一次样。取样后液氮速冻，存于-80 °C冰箱，以备用于基因克隆及基因表达分析。
[0029]2、样品总RNA提取及检测
(1)采用北京华越洋基因生物科技有限公司的多糖多酚植物RNA提取试剂盒(ZH120)提取荔枝样品总RNA ;用DNase I (TaKaRa)消化DNA ；
(2)RNA的浓度测定和纯度分析:取1.0 ml RNA溶液稀释至100.0 mL，用核酸蛋白检测仪测定260、280和320 nm的光吸收值，并计算260 nm/280 nm比值。当0D26Q/0D2S。的比值介于1.80?2.00时，RNA样品可用于下一步试验。总RNA样品浓度按下列公式计算:RNA浓度=0D26Q*40 ng mL 4100。为进一步评价总RNA的完整性，取2.0 mL总RNA进行1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。
[0030]3、合成cDNA第一链的和初始模板均一化利用MLV-Reverse Transcriptase Kit(Invitrogen公司)合成cDNA第一链，具体操作均按试剂盒说明书进行。用于定量表达分析的样品每个均取2.0 mg总RNA进行反转录。
[0031]4、引物设计根据引物设计的基本原则，用Primer Premier 5.0设计出引物，委托上海生物工程有限公司合成。
[0032]LcVRN2基因全长引物:
LcVRN2f:GAAATCAAATGTGCCATCA,
LcVRN2r:GCCGTCATACTCTTTAGCG ；
Real-time PCR 扩增引物:
Q LcVRN2f:G