TCTGACCGTTCCGTGCTTA，
Q LcVRN2r: TGGACTCGCCCAAATTACCT 0
[0033]5,PCR扩增、凝胶回收基因全长PCR扩增使用所有样品的cDNA混合样Mix作为模版，反应体系(50μυ为:25yL PCR缓冲液，21 μ L灭菌去离子水，I μ L HiFi Taq酶(北京全式金)，正向、反向引物各I yL(10yM)，cDNA模板I μ L。PCR扩增条件为:94°C变性3min ；94°C变性 0.5min，55°C退火 0.5min，72°C延伸 1.5min，35 个循环；72°C延伸 7min。PCR 产物电泳后，使用 TAKARA 的 Agarose Gel DNA Purificat1n Kit Ver 2.0 (编号为 DV805A)进行回收，具体操作参照试剂盒说明书。
[0034]6、连接、转化和测序回收的目的扩增片段于16°C与pMD18-T载体连接2_4h，连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，采用蓝白斑筛选转化子，取白斑进行菌落PCR检测，挑取检测呈阳性的转化子送公司测序。
[0035]7、成花调控基因VRN2基因同源序列分析测序后，将测序结果从NCBI上搜索同源序列进行比对，证实扩增片段为VRN2基因。利用DNAMAN 6.0等生物信息学软件对VRN2基因序列特征进行分析，结果显示:LcVRN2基因最大开放式阅读框长度为1272 bp，编码424个氨基酸，预测转录合成蛋白质分子量为47.11 KDa，等电点为4.95，命名为1^￥1^2。
[0036]通过从NCBI的GeneBank中搜寻下载其它物种已经登录的VRN2基因的核酸和氨基酸序列，发现目前仅仅只有少数髙等植物的VRN2基因被克隆登录。利用Clustal X和GENED0C等软件中对相关物种中VRN2基因编码的氨基酸序列进行同源性分析，发现荔枝中 VRN2 与苹果(Malus X domestica)、甘蓝(Brassica oleracea)和拟南芥(Arabidopsisthaliana)的同源性分别为67.22%、51.18%和50.71% (图2)。利用MEGA4.0软件选择连接近邻算法NJ (Neighbour joining)构建LcVRN2蛋白的系统进化树(图2)。进化系统树结果显示，荔枝中VRN2蛋白与苹果亲缘关系最近。
[0037]8、成花调控基因LcVRN2启动子序列分析对已克隆得到的基因序列进行启动子序列分析。启动子在线预测主要利用 PlantCARE (http://plantpan.mbc.nctu.edu.tw/seq_analysis, php)网络数据库。经过数据库比对分析后，推测启动子区域可能存在的顺式作用元件及可能影响基因表达的因素。
[0038]通过荔枝基因组测序结果获得了 LcVRN2基因起始密码子上游2000 bp左右的启动子序列，通过在线软件Plant CARE分析，发现在该基因的启动子区域内存在大量的调控元件。其中一些关键的顺式作用元件例如TATA-box和CAAT-box元件在这3个序列内大量存在，LcVRN2启动子中包含厌氧诱导和低温响应等环境响应元件，以及赤霉素、水杨酸、生长素、脱落酸和茉莉酸甲酯等植物内源激素的应答元件。通过这些基因启动子中存在响应元件可以发现LcVRN2基因启动和表达可能与温度、光照、以及内源激素存在较大关系，进一步推断这些温度、光照等外界环境因子和内源激素等内部因子都可能参与荔枝的成花过程。
[0039]二、成花调控基因LcVRN2基因的时空表达特征分析利用Real-time PCR对LcVRN2基因在荔枝成花过程、不同部位及不同温度处理条件下的表达特征进行分析。
[0040]具体方法如下:
(1)以每个样品均一化的CDNA作为模板，利用CFX96(B1-Rad公司)实时荧光定量PCR检测系统进行。反应体系(20yL)为:10yL 2X SYBR Mix，7 μ L灭菌去离子水，正向、反向引物各 IyL (10yM),cDNA 模板 lyL。反应条件如下:50°C，60 s ;95°C，60 s，95°C，15 s，56°C，15 s，72°C，35 s，40个循环；反应结束后通过熔解曲线鉴定产物的特异性；
(2)采用2ΔΔ?法进行数据分析，计算出荔枝成花基因在不同样品及不同处理中的表达水平。以上所有实验每个样品均设3次重复，用ddH20为阴性对照。内参基因选择表达稳定性良好的蒸枝Actin基因。
[0041]实时荧光定量表达结果显示:LcVRN2基因在荔枝成熟叶片、幼叶、叶芽、花芽、花穗和韧皮部中均有表达，表达量顺序依次为成熟叶片(2月份)> 幼叶(10月份)> 幼叶(2月份)> 成熟叶片(10月份)> 叶芽 > 花穗 > 花芽 > 韧皮部。叶片中LCVRN2基因在低温诱导2周后开始迅速增加，4周时达到较高值，并一直维持在一个较高水平直至开花，而顶芽中一直维持在一个较低水平，变化幅度不大；温室15°C处理实验叶片中LcVRN2基因在低温诱导3周后达到最高水平，然后逐渐下降；25°C处理叶片中LcVRN2基因一直维持在一个较低水平。说明LcVRN2基因在荔枝感受低温诱导和成花过程中发挥着重要作用。
[0042]三、成花调控基因LcVRN2基因的亚细胞定位
1、载体构建PBI121是常用的组成型植物表达载体，实验使用的是经过部分改造(用GFP代替pBI121中的⑶S基因)的pBI121载体，文中简称为pBI121-GFP载体。选取Xba I和Sma I两个酶切位点，将目的基因连接到含有GFP的载体中。
[0043]具体构建方法如下:
(1)植物表达载体PBI121-GFP的双酶切及回收酶切体系为:XbaI和Sma I各自2 μ L，PBI121-GFP载体36 μ L和5 μ L 10*Τ内切酶反应缓冲液，加水至50 μ L，37°C保温4 h。酶切后电泳检测并切胶回收相应大小的片段；
(2)扩增In-Fus1n改造的目的基因片段、产物回收及检测因本实验使用In-fus1n?HD Cloning Kit连接酶(Clontech)连接载体，具体原理及方法详见说明书。在基因编码区起始位置以及终止密码子之后选择一段序列，利用在线网站设计上下游引物使其含有线性载体两端15 bp接头的同源序列，用于扩增基因的编码区。这样扩增得到的目的基因片段两端就带有与载体两端同源的接头。PCR反应体系为1XPCR buffer 5 μ L、KOD酶I μ L、10mmol/LdNTP10yL、上下游引物各I yL、回收目的基因I μ L、加水至50 μ L。PCR反应程序见KOD酶说明书，产物的回收检测同上。
[0044]扩增带重组接头的目的基因引物:
LcVRN2- GFP-F:GGACTCTAGAGGATCCATGTGCCATCAAAATTCTTGLcVRN2- GFP-R:GATCGGGGAAATTCGAGCTCTCAGCTTTTTACAACATCTG
(3)目的基因连接pBI121-GFP载体经过In-Fus1n改造的目的基因片段与线性载体以3:1的摩尔比加入到连接体系中，在In-Fus1n酶的作用下，目的片段与线性载体两端的同源区域发生重组，使目的基因连接到载体上(具体原理详见说明书)。连接体系为:In-Fus1n改造的目的基因I μ L，酶切后的载体I μ L，In-Fus1n酶I μ L，加水至5 μ L。混匀后，50°C孵育15 min ；
(4)质粒转化及鉴定取2μ L连接产物用热激法转化至大肠杆菌，转化后活化菌株挑单克隆进行检测目的基因是否正确转入载体中。具体步骤如下:取100 μ L/管Ε.coli DH5a大肠杆菌感受态冰上融化；取2 μ L上述连接产物加入刚刚解冻的感受态细胞中，轻轻吸打混匀，冰上放30 min ;42°C热激60 S，冰上放置2 min ;加入500 μ L LB液体培养基(无抗生素)，37°C培养2 h ;取100 μ L菌液均匀涂布在含卡那霉素(Kan)的LB固体培养基上，37°C倒置过夜培养；挑取单克隆于LB液体培养基(含100 mg L 1 Kan)500 μ L，37°C培养3 h ;用pBI 121-GFP通用引物进行PCR检测，各取取3管条带正确的菌液100 μ L送华大基因公司测序，以验证质粒中是否含有目的基因。
[0045]2、农杆菌转化检测将测序正确、返还的质粒取5 μ L加入到100 yLGV3101农杆菌感受态细胞中(冰上解冻)，轻弹，经过冰上放置30 min、液氮中冷冻5 min、37°C水浴5min、冰浴2 min后，加入500 μ L YEP液体培养基28°C、180 rpm条件下振荡培养3 h ;取100 μ L菌液涂布在含50 mg.L 1利福平(Rif)和100 mg.L 1 Kan的YEP固体培养基上，28°C培养2-3 d ;挑取单菌于含抗生素的(50 mg.L 1Rif和100 mg.L 1Kan) YEP液体培养基