与京海黄鸡腹脂性状显著相关的特异分子标记及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于家禽育种领域，具体为根据基于第二代测序和简化基因组测序的特异 性位点扩增片段测序（SpecificLocusAmplifiedRragmentSequencing,SLAF-seq)技术 对京海黄鸡全基因组进行测序，利用生物信息学对测序数据进行分析，获得大量的特异单 链核巧酸多态性（SingleNucleotidePolymo;rphism,SNPs)分子标记，将得到的SNPs与京 海黄鸡腹脂性状进行全基因组关联分析，从而开发出1个与京海黄鸡腹脂性状显著相关的 SNPs标记，该SNPs标记不仅为京海黄鸡腹脂性状的分子标记辅助选择提供了重要的理论 与素材基础W及育种新思路，还为其他动物物种分子标记的开发提供了重要借鉴。
【背景技术】
[0002] 优质鸡是具有中国特色的地方品种肉鸡，其肉质鲜美，风味独特，被广大消费者所 喜爱，肌肉的风味与脂肪含量密切相关。肉鸡脂肪主要沉积在皮下、内脏（主要为腹脂、肠 胃周围脂肪）W及肌肉与骨骼等部位，其中腹脂是脂肪沉积的主要部位。从养殖角度考虑， 腹脂和肌内脂肪直接影响肉鸡的屠宰性状和肉质性状。其中，腹脂主要影响屠宰性状，腹脂 过多会造成肉鸡过肥，从而生产性能下降。因此，有必要对鸡腹脂性状进行遗传改良，虽然 过去几十年来采用传统育种方法对腹脂性状的遗传改良取得了显著的效果，然而腹脂性状 为复杂数量性状，受诸多基因的控制，如今，传统育种方法已很难对腹脂性状取得较大的遗 传进展。目前，一种新的育种新方法逐渐在动物育种领域得到应用，即全基因组关联分析 (Genome-wideAssociationStudy,GWA巧。全基因组关联分析旨在从全基因组范围内寻找 与性状关联的SNPs,得到的SNPs可用于分子标记辅助选择。京海黄鸡是在长期开展我国地 方鸡种质资源调查、评价与保护的基础上，经多年连续攻关成功培育而成的我国目前唯一 通过国家畜禽遗传资源委员会审定的具有小型、优质、早熟和抗逆四大特点的鸡新品种，京 海黄鸡的育成，即采用了常规育种方法，又采用了分子辅助选择方法，是鸡育种中理论与实 践相结合的一个范例。
【发明内容】
[0003] 本发明利用SLAF-seq技术在京海黄鸡全基因组范围内获得了 90961个SNPs标 记，结合全基因组关联分析获得了1个位于2号染色体上与京海黄鸡腹脂性状显著相关的 特异性SNPs标记。
[0004] 本发明所述与京海黄鸡腹脂性状显著相关的特异分子标记，是rs739907850,位于 2号染色体18144674bp处，突变类型为A/G突变，产生了S种基因型，分别为AA、BB和AB基 因型。 阳0化]本发明还公开了京海黄鸡2号染色体18144674bp位点作为与京海黄鸡腹脂性状 显著相关的特异分子标记的应用。
[0006] 该SNPs标记位于LIM和S册结构域蛋白2 (LASP-2)基因内部，该基因位于鸡参考 基因组2号染色体18006660-1825128化P，长244625bp，该基因可作为京海黄鸡腹脂重的候 选基因。
[0007] 一对用于扩增包含上述SNPs标记位点的通用引物，其序列如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示。
[0008] 本发明所述的1个SNPs标记获取自400只京海黄鸡核屯、群，样本容量大，可靠性 和准确性高，不仅可用于京海黄鸡腹脂多少的检测，还可用于京海黄鸡腹脂性状的遗传改 良，为京海黄鸡腹脂性状的分子标记辅助选择提供了重要的理论和素材基础。
[0009] 本发明利用SLAF-seq技术开发与京海黄鸡腹脂性状显著相关的SNPs标记，具有 通量高、重复性好、精度高等特点，为鸡乃至其他物种SNPs标记的开发提供了成功案例。
【附图说明】
[0010] 图1是京海黄鸡腹脂重全基因组关联分析的QQ-Plot图。
[0011] 图2是京海黄鸡腹脂重全基因组关联分析的曼哈顿图。
【具体实施方式】 阳〇1引实施例1阳〇1引 1.试验材料
[0014] 400只京海黄鸡核屯、群母鸡获取自江苏省南通市京海黄鸡育种场，60日龄翅静脉 采血1. 5ml，-20°C备用。43周龄屠宰分割，称取腹脂重，腹脂重描述性统计结果见表1。
[0015] 表1京海黄鸡腹脂重描述性统计
[0016]
[0017] 2.SLAF-seq技术方案设计
[0018]京海黄鸡基因组DNA(> 600ng)使用Dzup度Iood)GenomicDNAIsolation Reagent(上海生工生物工程有限公司）试剂盒提取，稀释至50-100yg/yL。利用 SLAF-seq技术对400只京海黄鸡进行分型，具体方法如下：首先，利用酶切位点预测软 件SLAF-Predict(Biomarker，Beijing,China),根据原鸡（Gallusgallus)基因组序列 的GC含量、重复序列W及基因特点预测酶切位点，设计标记开发方案，确定酶切方案、切 胶范围、测序量等W其分子标记开发的密度、均匀性，从而确保达到预期的实验目的。然 后，按照预先设计好的酶切方案，使用化eIII内切酶（New化glandBiol油S)酶切消化 基因组DNA，酶切后的片段在37°C条件下，使用克列诺片段（肥B)和dATP对末端添加一 个单核巧酸A碱基末端，使之与双标记标签测序接头（PAGE纯，LifeTechnologies)相 连。使用稀释后的酶切-连接DNA样本、dNTP、Q5高保真DNA聚合酶进行PCR反应，PCR 引物：AATGATACGGCGACCACCGA(SEQIDN0:3)和CAAGCAGAAGACGGCATACG(SEQIDN0:4) (PAGE纯，LifeTechnologies)，PCR产物使用Agencou;rtAMPureXP玻璃珠度eckman Coulter,化曲Wycombe,UK)纯化并收集，用琼脂糖凝胶电泳对收集后的片段大小进行选 择，具体为切胶 500-800bp的片段，使用QIAquickGelExtractionKit(QIAGEN)回收，切 胶回收的产物建库后使用Illumin址iSeqTM2000进行测序。测序产生的双端序列使用SOAP 2.20软件进行评估并比对，组装新的参考基因组，将双端序列与鸡参考基因组比对，使用平 均测序深度> 4的组来定义SLAF标签。
[0019] 3.基因分型和统计分析