一种大豆胞囊线虫胞囊寄生菌dna提取方法
【技术领域】
[0001]本发明属于核酸提取技术，具体涉及一种大豆胞囊线虫胞囊寄生菌DNA提取方法。
【背景技术】
[0002]大豆胞囊线虫(Heterodera glycines)是一种土传专性寄生线虫，属于异皮线虫属，由于形成胞囊的原因，有时也可称为胞囊线虫属，为大豆胞囊线虫病的主要病原，是大豆生产中一种常见的病害，同时也是大豆生产中的主要限制因子之一。大豆胞囊线虫病的防治方法主要有种植抗性品种、合理轮作、化学防治和生物防治等措施。而目前由于人们环保意识的提高，生物防治逐渐成为研究热点，利用自然界中大豆胞囊线虫自身天敌微生物防治该病害已经成为当今线虫学研究的新动向和新趋势。
[0003]目前世界上已报道的分离自大豆胞囊线虫各虫态上的真菌已达到125个属280余种。从胞囊上分离到的真菌主要包括:厚垣轮枝菌(又称厚孢普可尼亚菌Pochonia chlamydosporium)、淡紫拟青霉(Paecilomyces Iilacinus)、錯蚁轮枝菌(Verticillium Iecanii)、被毛抱(Hirsutella spp.)、谦抱菌(Fusarium spp.)、粘帚霉属(Gl1cladium sp.)、曲霉属(Aspergillus sp.)、腐枝霉属(Humicola sp.)、被毛枝葡萄抱(Botryotrichum piluliferum)、透明毛壳菌(Chaetomium perlucidum)、高大毛壳菌(C.elatum)、芽枝抱(Cladosporium cladospor1des)、雅致小克银汉霉、(Cunnighamellaelegans)、刺孢小克银汉霉(C.echinulata)、变异拟青霉(P.var1tii)、根异莖点霉(Paraphoma radicina)和异矛束抱菌(Doratomyces heterosporium)等。这些大豆胞囊线虫胞囊寄生真菌都是生物防治的重要资源。其中很多真菌都对大豆胞囊线虫能够产生很好的生防作用。
[0004]但是目前对于这些寄生真菌的研究都还主要集中在采用传统技术进行分离，具体方法是将经过表面消毒后的胞囊直接置于真菌培养基平板上进行真菌分离，并计算相应的分离频率。这种方法对于一些难于培养的寄生菌很难分离得到，所测结果会产生较大误差，因此很难准确提供出有关寄生菌群落结构和多样性信息，并且在DNA提取过程中有损失，胞囊用量大，提取时间长。
【发明内容】
[0005]本发明是要解决目前大豆胞囊线虫胞囊寄生菌的DNA提取过程中有损失，难准确提供出有关寄生菌群落结构和多样性信息，且胞囊用量大，提取时间长的问题，而提供一种大豆胞囊线虫胞囊寄生菌DNA提取方法。
[0006]大豆胞囊线虫胞囊寄生菌DNA提取方法，按以下步骤进行:
[0007]—、取100?150个新鲜的大豆胞囊线虫胞囊，用NaClO进行表面消毒，然后装入到已经灭菌的2mL离心管中，4°C条件下用灭菌去离子水浸泡18?24h，获得胞囊样品；
[0008]二、用土壤DNA抽提试剂盒进行胞囊样品的DNA提取，具体操作参照土壤DNA抽提试剂盒的使用说明书，即完成大豆胞囊线虫胞囊寄生菌DNA提取；
[0009]其中步骤一中大豆胞囊线虫胞囊的寄生率为50%以上。
[0010]本发明的优点:
[0011]利用现有的土壤 DNA 抽提试剂盒(E.Z.N.A.Soil DNA Kit, OmegaB1tek, Inc., USA)提取大豆胞囊线虫胞囊寄生菌DNA。该方法所需胞囊量少、步骤简单、容易操作，使用方便，DNA提取快速准确高效，便于推广应用。所提取的DNA可用于变性梯度凝胶电泳等微生物多样性分析，也可用于同类寄生微生物DNA的提取，能够更全面的了解胞囊寄生菌多样性及其种类，解决了难于培养微生物无法鉴定的问题。对进一步研究寄生菌对大豆胞囊线虫作用机理具有一定的推动作用。
[0012]本发明中提取DNA所需胞囊用量根据寄生菌寄生情况而定，如果胞囊寄生菌寄生率较低可适当提高胞囊用量，来获得更高浓度的DNA含量。
【附图说明】
[0013]图1是实施例中提取到的DNA用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测结果的电泳图，其中M为Marker，1-3泳道为大豆22年连作田间土壤中胞囊寄生菌DNA，4-6泳道为大豆3年连作田土壤中间胞囊寄生菌DNA，7-9泳道为小麦-玉米-大豆轮作田间土壤中胞囊寄生菌DNA ；
[0014]图2是实施例中提取到的DNA进行DGGE多样性分析的电泳图，1-3泳道为大豆22年连作田间土壤中胞囊寄生菌，4-6泳道为大豆3年连作田间土壤中胞囊寄生菌，7-9泳道为小麦-玉米-大豆轮作田间土壤中胞囊寄生菌。
【具体实施方式】
[0015]本发明技术方案不局限于以下所列举【具体实施方式】，还包括各【具体实施方式】间的任意组合。
[0016]【具体实施方式】一:本实施方式大豆胞囊线虫胞囊寄生菌DNA提取方法，按以下步骤进行:
[0017]—、取100?150个新鲜的大豆胞囊线虫胞囊，用NaClO进行表面消毒，然后装入到已经灭菌的2mL离心管中，4°C条件下用灭菌去离子水浸泡18?24h，获得胞囊样品；
[0018]二、用土壤DNA抽提试剂盒进行胞囊样品的DNA提取，具体操作参照土壤DNA抽提试剂盒的使用说明书，即完成大豆胞囊线虫胞囊寄生菌DNA提取；
[0019]其中步骤一中大豆胞囊线虫胞囊的寄生率为50%以上。
[0020]本实施方式步骤二中所用土壤DNA抽提试剂盒为E.Z.N.A.Soil DNA Kit, OmegaB1tek, Inc.，USA0
[0021]本实施方式中DNA提取的具体操作:
[0022]1、取0.5g玻璃珠置于装有胞囊样品的离心管中，加入ImL Buffer SLX Mlus，漩涡振荡3?5min ；
[0023]2、加 10yL Buffer DS，漩涡混匀；
[0024]3、70°C水浴lOmin，在水浴过程中漩涡混样，3000rpm,室温离心3min ；
[0025]4、取上清800 μ L于2ml离心管，加270 μ L Buffer SP2，漩涡混匀；
[0026]5、冰浴5min后，13000g，4°C离心5min，取上清于2mL离心管中，加0.7倍体积的异丙醇，颠倒混匀，4°C，13000g离心1min沉淀DNA ；
[0027]6、弃上清，将离心管倒置在滤纸上Imin吸干液体；
[0028]7、加 200 μ L Elut1n Buffer，旋振 10s，然后 65°C水浴 10 ?20min 溶解 DNA ；
[0029]8、加 50 ?100 μ L HTR Reagent，旋振 10s，室温静置 2min，13000g，离心 2min ；
[0030]9、取清澈上清于新的2mL离心管中，加入等体积的XP2Buffer，漩涡混匀；
[0031]10、将上述样品置于安装在2mL收集管上的HiBind DNA Column ;10000g，室温离心lmin，丢弃收集液^#DNA Column放在收集管上，加入300 μ L XP2Buffer ;10000g，离心Imin ;丢弃收集液和收集管；将DNA Column放在新的2mL收集管上，用700 μ L SPff WashBuffer洗脱柱子；10000g，离心lmin，丢弃收集液；用700 μ I SPff Wash Buffer再次洗脱，丢弃液体，将柱子再次放在空收集管上，13000g,室温离心2min ;将DNA Column放在干净的
1.5ml离心