固定脂肪酶的磁性氧化石墨复合物载体的制备方法及其固定脂肪酶的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及到一种固定化脂肪酶的载体的制备方法及其固定脂肪酶的方法。
【背景技术】
[0002]现代生物技术在化学领域得到了广泛应用，其中的酶催化反应高效，专一，但是也有一定的缺点，比如游离的脂肪酶做为催化剂使用时存在操作稳定性差、热稳定性差、容易受到有机溶剂影响而变性失活、难于分离回收再利用等缺点。这一缺点可以通过将酶固定于载体来克服，这样不仅可以保留酶原有的活性及高度选择性，而且还会提高酶处理效率、延长酶的使用寿命和降低处理成本，因此制备优良的固定化酶载体是当今社会的研究热点。其中利用磁性载体固定脂肪酶的技术也较多，如在2011年8月第8期的高分子学报的文章《单分散磁性纳米粒子固定化猪胰脂肪酶的研究》公开了一种固定化猪胰脂肪酶的方法，该方法是先用溶热法制备了 Fe3O4磁性纳米粒子，再用γ -氨基丙基三乙氧基硅烷对Fe3O4磁性纳米粒子进行表面改性，然后用戊二醛偶联法制得了固定化猪胰脂肪酶。该方法使用单一的磁球作为载体，负载的酶量少；而使用戊二醛作为交联剂，戊二醛的浓度要严格控制，浓度过大会使酶的构象发生改变，从而导致酶变性失活。
【发明内容】
[0003]本发明是要解决现有的利用磁性载体固定脂肪酶的方法的酶固定量低、容易导致酶变性的技术问题，而提供固定脂肪酶的磁性氧化石墨复合物载体的制备方法及其固定脂肪酶的方法。
[0004]本发明的固定脂肪酶的磁性氧化石墨复合物载体的制备方法按以下步骤进行:
[0005]—、采用溶剂热法制备Fe3O4纳米粒子；
[0006]二、采用stober法在Fe3O4纳米粒子外面包裹一层介孔娃，得到具有核壳结构的磁性介孔硅，记为Fe304@MCM-41 ；
[0007]三、采用hummers法制备氧化石墨；
[0008]四、按Fe304@MCM_41的质量与氧化石墨的质量比为1: (100?150)的比例称取步骤二制备的Fe304@MCM-41、量取步骤三制备的氧化石墨分散液，先把Fe304@MCM-41分散到无水乙醇中，再加入氧化石墨分散液，混合液搅拌I?2h，然后滴加3-氯丙基三乙氧基硅烷(CPS)，升温至120?130°C，搅拌回流10?12h，最后用无水乙醇洗涤干净，冷冻干燥，得到固定脂肪酶的磁性氧化石墨复合物载体，记为CPS/G0-Fe304@MCM-41。
[0009]利用上述的磁性氧化石墨复合物载体固定脂肪酶的方法，按以下步骤进行:
[0010]—、称取固定脂肪酶的磁性氧化石墨复合物载体CPS/G0-Fe304@MCM-41、pH为7.5的0.05M的磷酸盐(PBS)缓冲液、脂肪酶，其中CPS/G0-Fe304@MCM-41的质量与pH为7.5的0.05M的磷酸盐(PBS)缓冲液的体积的比为Ig: (30?50)ml ；CPS/G0-Fe304iMCM-41与脂肪酶的质量比为10:(0.36?I);
[0011]二、将pH为7.5的0.05M的磷酸盐(PBS)缓冲液分成两份，向一份中加入CPS/G0-Fe304@MCM-41，搅拌I?12h，得到载体溶液；向另一份中加入脂肪酶振荡直至完全溶解，得到酶溶液；将酶溶液加入到载体溶液中，放在恒温振荡器中在25?50°C、150rpm的条件下恒温振荡2?12h，然后用磁分离进行收集，将收集到的固相物用PBS缓冲液洗涤干净，冷冻干燥，得到磁性氧化石墨复合物固定化脂肪酶。
[0012]本发明提供了一种操作简便、环保具有工业化前景的固定脂肪酶的磁性氧化石墨复合物载体的制备方法及其固定脂肪酶的方法，磁性氧化石墨复合物载体以氧化石墨为“衬底”，通过共价结合的方式接枝磁性介孔硅，采用氯硅烷偶联剂(3-氯丙基三乙氧基硅烷)共价固定在氧化石墨表面。脂肪酶可以通过共价结合的方式固定在载体上。
[0013]氧化石墨表面附有的大量羧基，通过共价结合的方式在表面接枝功能基团氯硅烷，再将酶固定在磁性氧化石墨复合纳米粒子表面，氧化石墨烯具有比表面积大、生物兼容性好以及良好的机械稳定性的优点，既能加载大量的酶，又能够较好的保存酶原有的催化活性，提高重复使用性。
[0014]氯硅烷偶联剂能够有效减小空间阻碍，从而能够使更多的酶与载体材料结合。氧化石墨作为“衬底”与磁性介孔硅结合提供了较大的比表面积，载体表面丰富的基团能结合更多的硅烷偶联剂，使硅烷偶联剂的接枝率达到10%。相比于其他方式固定化酶，以共价键方式结合的酶更加牢固，不易从载体上脱落。氧化石墨优良的机械稳定性使得固定化酶的重复性增强了。
[0015]由于复合物有磁性，在外加磁场力的作用下，还能够很方便地回收再利用。
[0016]通过紫外可见光谱分析换算得到固定化效率高达98 %。采用国标滴定法检测固定化酶活性。当磁性氧化石墨复合物固定化脂肪酶浓度为3.6mg/mL，pH为7.5，温度为40°C时，固定化相对酶活达到初始浓度的97%。在30°C储存56天及循环使用10次后，固定化相对酶活分别达到初始浓度的85%，87%。CPS/G0-Fe304@MCM-41作为载体利于酶的回收，再利用，符合绿色化学的发展趋势，具有良好的工业前景。
[0017]本发明的磁性氧化石墨复合物固定化脂肪酶可用于酶催化反应中。
【附图说明】
[0018]图1试验I制备的固定脂肪酶的磁性氧化石墨复合物载体的透射电镜照片；
[0019]图2试验I制备的固定脂肪酶的磁性氧化石墨复合物载体的XPS谱图；
[0020]图3试验I制备的固定脂肪酶的磁性氧化石墨复合物载体中Fe2p高分辨率扫描XPS谱图；
[0021]图4试验I制备的固定脂肪酶的磁性氧化石墨复合物载体中氧化石墨(GO)的CIs高分辨率扫描XPS谱图；
[0022]图5试验I制备的固定脂肪酶的磁性氧化石墨复合物载体红外光谱图；
[0023]图6试验I制备的固定脂肪酶的磁性氧化石墨复合物载体的热重分析图。
【具体实施方式】
[0024]【具体实施方式】一:本实施方式的固定脂肪酶的磁性氧化石墨复合物载体的制备方法按以下步骤进行:
[0025]一、采用溶剂热法制备Fe3O4纳米粒子；
[0026]二、采用stober法在Fe3O4纳米粒子外面包裹一层介孔娃，得到具有核壳结构的磁性介孔硅，记为Fe304@MCM-41 ；
[0027]三、采用hummers法制备氧化石墨；
[0028]四、按Fe304@MCM_41的质量与氧化石墨的质量比为1: (100?150)的比例称取步骤二制备的Fe304@MCM-41、量取步骤三制备的氧化石墨分散液，先把Fe304@MCM-41分散到无水乙醇中，再加入氧化石墨分散液，混合液搅拌I?2h，然后滴加3-氯丙基三乙氧基硅烷(CPS)，升温至120?130°C，搅拌回流10?12h，最后用无水乙醇洗涤干净，冷冻干燥，得到固定脂肪酶的磁性氧化石墨复合物载体，记为CPS/G0-Fe304@MCM-41。
[0029]【具体实施方式】二:本实施方式与【具体实施方式】一不同的是=Fe3O4纳米粒子的制备方法如下:按六水合三氯化铁(FeCl3.6H20)与硝酸钠的质量比为1: (2?3)将六水合三氯化铁与硝酸钠溶解在乙二醇中，然后转移到反应釜中，升温至190?200°C并保持19?20h，然后降至常温，将得到的沉淀物分别用无水乙醇和丙酮洗涤干净，最后用磁铁收集，将收集的黑色产物在50?60°C条件下真空干燥，得到Fe3O4纳米粒子；其它与【具体实施方式】一相同。
[0030]【具体实施方式】三:本实施