一种固定化环脂肽脱酰酶的制备方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术中的酶固定化技术领域；具体地，本发明设及一种固定化环 脂肤脱酷酶的制备方法及其应用。 技术背景
[0002] 棘白菌素类抗生素是20世纪70年代发现的一类具有抑制0 -1，3-葡聚糖合成酶 活性的天然产物，具有很好的抗真菌活性，其基本结构如式1所示。由于天然棘白菌素类化 合物所具有的R2脂肪酸侧链，在人体具有一定的溶血毒性，因此已经上市的米卡芬净和阿 尼芬净等芬净类抗真菌药物都是将天然化合物的原有脂肪酸侧链脱去，换上不同的脂肪酸 侧链。由于侧链脱去的过程很难用化学法完成，一般采用环脂肤脱酷酶值eacylase)进行 生物转化。
[0003]
[0004] 式1 :棘白菌素类化合物基本结构式巧1:-邸3或-H;R2:C15-C。链；1?3:-邸3或-H; R4:-0H或-OSOsH;R5:-0S0sH或-H;Re:-〇H或-H;R7:CH3或CH2CONH2) 阳0化]已经报道的环脂肤脱酷酶值ea巧Iase)均来源于犹他游动放线菌（Actinoplanes Ut址ensis)或者环圈链霉菌（Str巧tomycesanulatus)。文献报道的生物转化方法中，一 般采用前体发酵法转化，即首先将微生物进行产酶培养，然后直接将底物添加到发酵体系 中进行转化。该方法有很多缺点，如转化体系中底物与产物浓度低、反应时间长、液体处理 体积大、体系中杂质多（培养基成份W及有机溶剂）、产物后处理困难、纯化难度大等。另外 运一发酵体系不可重复使用，成本高。
[0006] 酶固定化可较好的解决上述问题。一般认为，比如专利申请《一种固定化环脂肤酷 基转移酶及其制备方法和用途，201210148392. 7》，酶固定化时最好先将酶进行纯化（如离 子交换、分子筛、疏水层析与超滤透析等，根据需要单独或组合进行），酶液中杂蛋白比例越 小越有利于固定化。运是因为，发酵液中存在很多色素、氨基酸、细胞碎片、次级代谢产物等 各种杂质；酶相对于各种杂质的浓度偏低，杂质会抑制固定化载体的活力；同时杂质中含 有的活性基团会对亲水性载体的结合位点进行竞争性结合，造成固定化酶活回收率低。
[0007] 然而酶纯化过程会造成酶的损失，而且需要额外的设备，增加了成本。
[0008] 酶固定化过程中，载体和蛋白质氨基酸残基的反应特异性由化学性质和微环境 (包括介质组成、离子强度、抑等）决定。遵循运一思路，本发明的目的是找到合适的条件， 发酵液无需纯化，固定化载体就可选择性的与发酵液中的环脂肤脱酷酶结合，减少与杂质 的结合，获得有工业价值的固定化环脂肤脱酷酶。
【发明内容】
[0009] 本发明公开了一种从发酵液中特异性的固定环脂肤脱酷酶的方法。
[0010] 本发明公开的方法，包括W下步骤：
[0011] 将含有环脂肤脱酷酶的发酵液和菌丝体经过滤分离后得到游离的环脂肤脱酷酶 溶液；
[0012] 将游离的环脂肤脱酷酶溶液不经纯化，直接与多孔亲水性酶载体混合，并加入一 种或多种有机溶液和无机盐，得到固定化环脂肤脱酷酶。 阳〇1引其中所述
[0014] 游离的环脂肤脱酷酶溶液与载体的混合比例为每克载体需酶活为9-60000U，优选 为每克载体需酶活为45-360U。
[0015] 含有游离的环脂肤脱酷酶溶液和载体混合时体系抑值为5-11。
[0016]多孔亲水性酶载体选自W聚甲基丙締酸醋为基体键合环氧化物的酶载体。特别优 选为化pergitCM或LX1000-EP中的任一种。
[0017] 有机溶液为乙醇、异丙醇、正己烧、DMS0、丙酬、DMF、四氨巧喃、化晚、乙腊中的任一 种，优选为乙醇、异丙醇、丙酬中的任一种。
[0018] 无机盐为氯化钢、氯化钟、氯化儀、氯化锋中的任一种，优选为氯化钟、氯化儀中的 任一种。
[0019] 含有游离的环脂肤脱酷酶溶液和载体混合的溫度为5-80°C，优选为10-40°c，最 优选为20-30°C。
[0020] 含有环脂肤脱酷酶的发酵液是指来源于天然能产生环脂肤脱酷酶的微生物菌株， 或者运些微生物菌株的人工突变体、或者变种，或者含有环脂肤脱酷酶编码基因的基因工 程菌株。
[0021] 本发明还公开了将运种固定化环脂肤脱酷酶的制备方法在制备棘白菌素类药物 母核中的应用。
[0022] 其中所述棘白菌素类药物母核为米卡芬净母核或阿尼芬净母核。
[0023] 在本发明中，上述酶活单位定义为：40°C时，在1小时内生成1微摩尔产物所需的 酶量，即定义为1U。产物测定步骤为：分别量取17. 5mL粗酶液，含有米卡芬净前体或阿尼 芬净前体的憐酸（0. 2mol/l，抑5. 5)缓冲液5mU甲醇2. 5mL。40°C水浴条件下，反应1小 时，去离子水适当稀释，0. 22ym尼龙膜过滤，HPLC测定产物米卡芬净母核或阿尼芬净母核 浓度。
[0024] 本发明将含有环脂肤脱酷酶的发酵液和菌丝体简单分离后，无需其他酶纯化步 骤，直接与固定化载体混合，实现环脂肤脱酷酶与固定化载体的高效结合，获得有工业价值 的固定化环脂肤脱酷酶。本发明所提供的固定化条件增强了固定化载体中环氧基团与目标 酶的选择性结合，减少与杂质的结合，克服了粗酶液不利于固定化的难点。与W往方法相 比，运种制备方法工艺简单，不仅节省了酶纯化设备，而且固定化过程中酶活回收率明显提 高，固定化酶可多次重复使用。酶法转化米卡芬净和阿尼芬净中间体，相比发酵转化法反应 底物浓度高，产物杂质少，转化效率高。
【具体实施方式】
[00巧]下面结合具体实施例对本发明作进一步阐释。
[00%] 实施例1环脂肤脱酷酶溶液的获得
[0027] 1. 1犹他游动放线菌（ActinoplanesUt址ensis)产生的环脂肤脱酷酶
[0028] 采用犹他游动放线菌IF0-13244菌株，按照专利US5376634中实施例1所述的发 酵方法，进行发酵培养，得到菌丝体培养液15化。然后于铺有滤纸的布氏漏斗过滤，收集含 有环脂肤脱酷酶的滤液12化，即游离的环脂肤脱酷酶溶液，收集滤液，经HPLC检测，酶活为 0. 864X1〇5u。
[00巧]1. 2链霉菌（Str巧tomycessp.)产生的环脂肤脱酷酶
[0030] 采用链霉菌6907号菌株，按照专利W097/32975中实施例1所述的发酵方法，进行 发酵培养，得到菌丝体培养液15化。然后于铺有滤纸的布氏漏斗过滤，收集含有环脂肤脱酷 酶的滤液130L，即游离的环脂肤脱酷酶溶液，收集滤液，经HPLC检测，酶活为0. 768XIO5Ud
[0031] 1. 3含外源环脂肤脱酷酶基因的重组链霉菌产生的环脂肤脱酷酶
[0032]按文献方法（Appliedand!EnvironmentalMicrobiology, 2013，V79. 4， 1126-1133)从犹他游动放线菌中克隆环脂肤脱酷酶基因，并重组至链霉菌的基因组中。妇b 取重组转化子活化，并扩大培养进行表达，得到菌丝体培养液15化。然后于铺有滤纸的布氏 漏斗过滤，收集含有环脂肤脱酷酶的滤液12化，即游离的环脂肤脱酷酶溶液，收集滤液，经 HPLC检测，酶活为 0. 606XIO5Ud
[0033] 实施例2不同类型环氧化物载体的选择
[0034] 取上述实施例1中1.1所制备得到游离的环脂肤脱酷酶溶液，分别加入Ig EupergitCM或LX1000-EP，25°C揽拌24小时，过滤收集固定化环脂肤脱酷酶，纯水洗涂S 次，室溫干燥3小时，最后进行酶活测定。
[0035] 表1不同类型环氧化物载体对原始游离酶液的固定情况
[0036]
[0037] 从表I可^看出，相同酶用量条件下载体LX1000 -EP的回收率均高于载体 Eupergit CM〇
[0038] 表2环氧化物载体LX1000-EP对原始游离酶液的固定情况
[0039]
[0040] 从表2可W看出，在游离的环脂肤脱酷酶溶液与载体的混合比例为9-60000U/g 范围内，均可W实现游离酶的固定化，酶活回收率在5%W上的组别中每克载体需酶活为 45-360U。
[0041] 综合表1和表2可W看出，酶液未经纯化直接加入载体处理，固定化过程中酶活回 收率较低，不能满足实际应用的需要。
[0042] 实施例3固定化过程中水溶液极性的优化
[0043] 取实施例1中1. 1所制备得到游离的环脂肤脱酷酶溶液比，分别加入不同类型有 机溶剂（包括乙醇、