异丙醇、正己烧、DMSO、丙酬、DMF、四氨巧喃、化晚、乙腊）各50血、100血、 200mL或300mL。继续分别加入5gLX1000-EP载体，25°C揽拌24小时，过滤收集固定化环 脂肤脱酷酶，纯水洗涂=次，室溫干燥3小时，最后进行酶活测定。
[0044] 表3不同有机溶剂的环脂肤脱酷酶固定化
[0045]
[0047] 从表3可W看出，在游离的环脂肤脱酷酶溶液中，加入不同类型有机溶剂，包括乙 醇、异丙醇、正己烧、DMS0、丙酬、DMF、四氨巧喃、化晚、乙腊，其固定化酶活回收率都有一定 的提升。其中乙醇、异丙醇和丙酬的效果特别明显，其最适添加浓度为10%。
[0048] 实施例4固定化过程中离子强度和抑值的优化
[0049] 取实施例1中1. 1所制备得到游离的环脂肤脱酷酶溶液1L，加入异丙醇IOOmL, 同时分别加入不同类型无机盐（包括氯化钢、氯化巧、氯化钟、氯化儀、氯化锭、氯化锋）各 Imol,并调节成不同的抑值。继续分别加入5gLX1000-EP载体，25°C揽拌24小时，过滤收 集固定化环脂肤脱酷酶，纯水洗涂=次，室溫干燥3小时，最后进行酶活测定。 阳化0]
[0051] 从表4可W看出，游离的环脂肤脱酷酶溶液，在不添加无机盐时，在抑值为5-11 范围内，均可W实现游离酶的固定化，优选抑值为8-10。添加氯化钢、氯化钟、氯化儀、氯化 锋等无机盐后，获得的固定化颗粒酶活都有一定的提升。其中氯化钟和氯化儀的效果特别 明显，在抑值为9时添加Imol/L氯化钟固定化效果最佳，固定化颗粒酶活为100. 8U/g，固 定化酶活回收率为70.0%。
[0052] 实施例5固定化过程中溫度和酶液量与载体量混合比例的优化
[0053] 取实施例1中1. 1所制备得到游离的环脂肤脱酷酶溶液1L，加入异丙醇IOOmL和 氯化钟Imol,并调节抑值为9。继续分别加入LX1000-EP载体4g、5g、6g或7g，在不同溫度 下，揽拌24小时，过滤收集固定化环脂肤脱酷酶，纯水洗涂=次，室溫干燥3小时，最后进行 酶活测定。
[0054] 表5不同溫度和载体量的环脂肤脱酷酶固定化 阳化引
[0056] 从表5可W看出，在游离的环脂肤脱酷酶溶液与载体的混合溫度为5-80°C范围 内，均可W实现游离酶的固定化，其中10-40°C的效果更好，20-30°C的效果最佳。游离的环 脂肤脱酷酶溶液与载体的混合比例最优选为IL酶液中加入6g载体。
[0057] 实施例6环脂肤脱酷酶的纯化W及固定化
[0058]参照文献方法（JournalofIndustrialMicrobiology&Biotechnology，2000， 24,173-180)纯化实施例I中I.I所制备得到游离的环脂肤脱酷酶溶液12化，即酶活为 0. 864XIO5U,得到纯化的环脂肤脱酷酶溶液3L，经HPLC检测，酶活为0. 173XIO5U,纯化酶 活收率为20.0%。
[0059] 取上述经纯化的环脂肤脱酷酶溶液比，调节抑值为7,分别加入30gEupergitCM 载体或30g LX1000-EP载体，25°C揽拌24小时，过滤收集固定化环脂肤脱酷酶，纯水洗涂S 次，室溫干燥3小时，最后进行酶活测定。
[0060] 表6环氧化物载体对纯化游离酶液的固定情况
[0061]
[0062] 从表6可W看出，实施例1中1. 1所制备得到游离的环脂肤脱酷酶溶液12化，纯化 后得到环脂肤脱酷酶溶液化，纯化酶活收率为20. 0%，虽然固定化酶活回收率很高，可W 达到90. 0%，但是由于纯化酶活收率低，酶活总回收率只有18. 0%。
[0063] 实施例7大体系固定化环脂肤脱酷酶 W64] 取实施例1中1.1所制备得到游离的环脂肤脱酷酶溶液100L，即酶活为 0. 720XIO5U,加入异丙醇IOL和氯化钟IOOmol，并调节抑值为9。继续加入600gLX1000-EP 载体，25°C揽拌24小时，过滤收集固定化环脂肤脱酷酶，纯水洗涂=次，室溫干燥3小时。经 测定，收集的固定化环脂肤脱酷酶颗粒酶活为98. 6U/g，固定化酶活回收率为82. 2%。 阳〇化]实施例8固定化环脂肤脱酷酶催化生产米卡芬净母核
[0066] 将2g米卡芬净前体和10血甲醇加入憐酸（0.Imol/L，抑5. 5)缓冲液并定容至 1〇〇"1以再加入由实施例7制备的固定化环脂肤脱酷酶颗粒lOg。40°C，240rpm摇床反应。反 应8小时后，HPLC检测，米卡芬净母核的摩尔产率为98%。
[0067] 实施例9固定化环脂肤脱酷酶催化生产阿尼芬净母核 W側将2g阿尼芬净前体和10血甲醇加入憐酸（0.Imol/L，抑5.W缓冲液并定容至 1〇〇"1以再加入由实施例7制备的固定化环脂肤脱酷酶颗粒lOg。40°C，240rpm摇床反应。反 应15小时后，HPLC检测，阿尼芬净母核的摩尔产率为95%。
[0069] 实施例10固定化环脂肤脱酷酶批次催化生产米卡芬净母核
[0070] 按实施例8的方法使用固定化环脂肤脱酷酶催化生产米卡芬净母核。结束反应 后，过滤收集固定化环脂肤脱酷酶，并用纯水洗涂=次，收集的固定化环脂肤脱酷酶，继续 按实施例8的方法催化生产米卡芬净母核。重复20次，每次均记录米卡芬净母核的产量， 如表7所示。
[0071] 表7固定化环脂肤脱酷酶批次催化生产米卡芬净母核
[0072]
[0073] 从表7可W看出，按实施例8的方法使用固定化环脂肤脱酷酶催化生产米卡芬净 母核。固定化环脂肤脱酷酶可W重复使用20次，前17次可W保持95%W上的产率。
[0074] 用实施例1中其他两种方法制备得到游离的环脂肤脱酷酶溶液重复W上试验，可W得到基本相似的试验结果。
【主权项】
1. 一种固定化环脂肽脱酰酶的制备方法，包括以下步骤： 将含有环脂肽脱酰酶的发酵液和菌丝体经过滤分离后得到游离的环脂肽脱酰酶溶 液； 将游离的环脂肽脱酰酶溶液不经纯化，直接与多孔亲水性酶载体混合，并加入一种或 多种有机溶液和无机盐，得到固定化环脂肽脱酰酶； 其中所述游离的环脂肽脱酰酶溶液与载体的混合比例为每克载体需酶活为9-60000U ; 含有游离的环脂肽脱酰酶溶液和载体混合时体系PH值为5-11。2. 如权利要求1所述的制备方法，所述多孔亲水性酶载体选自：以聚甲基丙烯酸酯为 基体键合环氧化物的酶载体。3. 如权利要求2所述的制备方法，所述多孔亲水性酶载体为Eupergit CM或LX1000-EP 中的任一种。4. 如权利要求1所述的制备方法，所述有机溶液为乙醇、异丙醇、正己烷、DMSO、丙酮、 DMF、四氢呋喃、吡啶、乙腈中的任一种，优选为乙醇、异丙醇、丙酮中的任一种。5. 如权利要求1所述的制备方法，所述无机盐为氯化钠、氯化钾、氯化镁、氯化锌中的 任一种，优选为氯化钾、氯化镁中的任一种。6. 如权利要求1所述的制备方法，所述含有游离的环脂肽脱酰酶溶液和载体混合的温 度为5-80 °C，优选为10-40 °C，最优选为20-30 °C。7. 如权利要求1所述的制备方法，所述游离的环脂肽脱酰酶溶液与载体的混合比例， 优选为每克载体需酶活为45-360U。8. 如权利要求1所述的制备方法，所述含有环脂肽脱酰酶的发酵液是指来源于天然能 产生环脂肽脱酰酶的微生物菌株，或者这些微生物菌株的人工突变体、或者变种，或者含有 环脂肽脱酰酶编码基因的基因工程菌株。9. 如权利要求1至8中任一所述方法在制备棘白菌素类药物母核中的应用。10. 如权利要求9所述的应用，所述棘白菌素类药物母核为米卡芬净母核或阿尼芬净 母核。
【专利摘要】本发明公开了一种固定化环脂肽脱酰酶的制备方法。环脂肽脱酰酶溶液不经纯化，直接与多孔亲水性酶载体混合，并加入一种或多种有机溶液和无机盐，得到固定化环脂肽脱酰酶；同时公开了这一方法可用于工业化生产米卡芬净母核和阿尼芬净母核。本发明公开的制备方法工艺简单，不仅节省了酶纯化设备，而且固定化过程中酶活回收率明显提高，固定化酶可多次重复使用。酶法转化米卡芬净和阿尼芬净中间体，相比发酵转化法反应底物浓度高，产物杂质少，转化效率高。
【IPC分类】C12N11/08, C12P21/04
【公开号】CN105154424
【申请号】CN201510626188
【发明人】冯国栋, 陈振明, 陈晓霞, 赖敦岳, 周硕, 朱健
【申请人】杭州华东医药集团新药研究院有限公司, 杭州师范大学
【公开日】2015年12月16日
【申请日】2015年9月28日