pH稳定性和热稳定性提高的突变体内切葡聚糖酶及其编码基因和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程和蛋白质工程领域，具体设及抑稳定性和热稳定性提高的 突变体内切葡聚糖酶EG5AP1及其编码基因和应用。
【背景技术】
[0002] 0-葡聚糖广泛存在于大麦、小麦、黑麦，燕麦，水稻和高梁等谷类经济作物的糊粉 层和胚乳细胞壁中，属于植物细胞壁中的结构性非淀粉多糖，具有线型的空间结构。0-葡 聚糖是由D型葡萄糖W不同比例的0-1，3和0-1，4糖巧键连接而形成的长链多糖聚合 物。0-葡聚糖链通过分子内和分子间氨键的紧密排列形成不可溶的纤维素微丝。
[0003] 0-内切葡聚糖酶是纤维素酶系中的一个重要组成部分，它作用于纤维素分子内 部的非结晶区，随机水解0 -1，4-糖巧键，将长链纤维素分子降解产生小分子葡聚糖或葡 萄糖。0-葡聚糖酶在工业中的应用十分广泛，如啤酒酿造、动物饲料添加及食品加工等。 其中酸性葡聚糖酶主要应用于饲料行业，0 -葡聚糖作为一种非淀粉粘性多糖，在肠道内吸 收较多的水分后，具有较高的粘度，阻止肠道消化液与食糜充分接触，从而影响营养物质的 吸收，成为一种抗营养因子。动物饲料中添加P-葡聚糖酶可W帮助动物分解麦类成份（大 麦、小麦及燕麦），提高饲料中营养物质的利用率，促进动物的消化吸收和生长发育。
[0004] 在饲料工业中，动物胃肠道是酸性环境，而且在饲料的加工过程中，有一个短时的 高溫过程，因此研究挖掘耐高溫、耐酸碱及高比活的酶将具有更高的商业价值及竞争性。而 自然界分离得到的酶很难满足工业需求，因此通过分子改良的方法，理性设计提高酶的稳 定性是目前学术及产业界持续努力的目标。5家族内切葡聚糖酶EG5AP1是一种高溫酸性 酶，最适溫度75°C，最适抑5. 0,不具备胃蛋白酶抗性，但其应用于饲料行业中时需要在酸 性（PH2.0)条件下具有高酶活且能保持稳定，具有胃蛋白酶抗性。为了使其更好地应用于 饲料行业，需要对该酶进行分子工程改造，W提高其嗜酸、耐酸性质，从而具备胃蛋白酶抗 性。本发明通过定点突变的方法设计突变体来改良EG5AP1的抑稳定性及热稳定性，进而 有效地提高其在工业上的应用价值。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供抑稳定性和热稳定性提高的突变体内切葡聚糖酶EG5AP1。
[0006]本发明的再一目的是提供编码上述突变的内切葡聚糖酶EG5AP1的基因。
[0007]本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。
[0008] 本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。
[0009] 本发明的另一目的是提供一种制备上述突变的内切葡聚糖酶EG5AP1的基因工程 方法。
[0010] 本发明的另一目的提供上述突变的内切葡聚糖酶EG5AP1的应用。 阳011]本发明对内切葡聚糖酶EG5AP1 (其氨基酸序列如SEQIDNO. 1所示，核巧酸序列 如SEQIDNO. 2所示）进行定点突变，分别将177、261、288、333位谷氨酷胺突变为谷氨酸。 阳01引 内切葡聚糖酶EG5AP1氨基酸序列如SEQIDNO. 1所示：
[0013] MKASTIICA化PLALAVPNARRASGFVCMFP化LFIAEADGEIGFGS肥SGAEFGETKLPGVLGTDYIW PDASTIKTLHDAGMNIFRVAFRME化IPDKMTGTPDATYMNDLKATVNA口化GAYAVIDPHNYGRYYGNIISSTDD FAAFWKTVAAQFASNDHVIFDTNNEYHDMDETLVLNLNQAAINAIRAAGATSQYIFVEGNSWSGAWTWTNVNDNLKA LTDPQDKIVYEMHQYLDSDGSGTSATCVSSTIG犯RVQSATQWLKTNGKKGIIGEFAGGPNSVCQSAVTGMLD化SA NSDVWMGAAWWAAGPWWADYMFSMEPPSGTGYQNYLSLLKPYFVGGSGGNPPTTTTTTTSKPTTTTTTAGNPGGTGV AQHWGQCGGIGWKGPTACATPYTCQKLNDYYSQ化
[0014] 内切葡聚糖酶EG5AP1的基因序列如SEQIDNO. 2所示：
[0015] atgaaggcttcgactattatctgtgcacttctcccccttgctttggcggtgccgaatgcgaggcgggct tctgggtttgtttgtatgtttccctttcttctcttcatcgcagaagctgacggtgagatagggtttggaagtaacga gtctggcgccgagtttggagagaccaagctcccgggcgtgctggggacggattatatctggcccgatgcgtcgacta tc过过g过ctctgc过tg过tgccggg过tg过过C过tcttccgtgttgcgttccggstggsgsggctcstcccggstssgstg acggggactccagatgcgacgtacatgaatgatctcaaggcgactgtcaatgcgattacgagtctgggggcgtatgc ggtgattgatccccataactatggaagatactacgggaacatcatctcgtcgactgacgactttgctgcgttctgga agaccgtggctgcccagtttgcgtccaatgaccatgtcatttttgacaccaacaatgagtaccatgatatggaccag acgctcgttctcaacctcaaccaggctgccatcaacgccatccgtgctgcaggcgccacctcgcagtacatttttgt Cgagggcaactcgtggtccggcgcgtggacctggaccaacgtcaacgacaacctcaaggccctcaccgaccctcagg ataagatCgtCtacgagatgcaccagtatCtGgactcagacgggtccggcacgtGggccacctgcgtgagetccacc 过tcggcc过gg过gcgcgtgc过gtccgcc过C过C过gtggttg过过g过CC过过tggt过过g过过过ggt过tc过t过ggcg过gttcgc tggaggccccaacagcgtgtgccagtCCgCtgtcacaggcatgcttgactacttgtCtgccaactCggatgtgtgga tgggcgcagcatggtgggccgctggtccctggtgggcagattatatgttcagcatggagccgccgtctggcactggc tatcagaactatctctcgttgttgaagccgtatttcgtcggtggttcgggtggtaaccctccaacgaccaccacgac 过过Ct过CC过gC过过gCCt过Ct过Cg过CC过Ct过CC过Cggctggg过过CCCtggCggC过CCgg过gtCgC过CSgCSCtggggCC agtgtggtggaattggatggaagggtCCgactgeetgcgccacgccatatacctgccagaagctgaacgactactac tctcaatgcctgtag
[0016] 所述构建方法为，设计各突变引物，W编码内切葡聚糖酶EG5AP1基因的野生型质 粒PPIC9 丫 -e巧APl为模板依次进行两轮PCR扩增。纯化得到含有突变密码子的质粒，并将 其转化进毕赤酵母感受态细胞GSl15中进行表达，得到重组突变体蛋白。
[0017] 所述的pPIC9 丫-e巧APl的构建方法为，W化osartoiyafischeriPl的cDNA 为模板，W引物EG5-F和EG5-R对EG5AP1基因进行扩增。电泳纯化PCR产物中的目的 条带，用EorRI和NotI将PCR产物和PPIC9 丫质粒进行双酶切，T4连接酶连接后得到 PPIC9 丫 -e巧APl重组质粒，使该核巧酸序列位于AOXl启动子的下游并受其调控。
[0018] 所述构建PPIC9 丫 -e巧APl的引物是：
[0019] EG5-F:5' -GCCGAATTCATGAAGGCTTCGACTATTAT-3'(沈QNO. 3)
[0020] EG5-R:5'-GCCGCGGCCGCCTACAGGCATTGAGAGTAGTA-3'(SEQNO. 4)
[0021] 所设计的用于定点突变的引物为：
[0022] Q177E-F:5' -CATGATATGGACGAGACGCTCGTTCTC-3'(SEQNO. 5)
[0023] Q177E-R:5'-TGTGACAGCGGACTGGCACACGCTGTT-3'（SEQNO. 6)
[0024] Q261E-F:5'-CAGGAGCGCGTGGAGTCCGCCACACAG-3'(SEQNO. 7) 阳O巧]Q261E-R:5'-CGAGAGATAGTTCTGATAGCCAGTGCC-3'(沈QNO. 8)
[0026]Q288E-F:5'-CATGATATGGACCAGACGCTCGTTCTC-3'（SEQNO. 9)
[0027]Q288E-R:5'-TGTGACAGCGGACTGGCACACGCTGTT-3'(SEQNO. 10)
[0028] Q333E-F:5'-CAGGAGCGCGTGCAGTCCGCCACACAG-3'(沈QNO. 11)
[0029]Q333E-R:5'-CGAGAGATAGTTCTGATAGCCAGTGCC-3'(SEQNO. 12) W30] 本发明通过PCR的方式引入突变，获得突变体内切葡聚糖酶EG5AP1W及编 码基因。本发明还提供了包含上述内切葡聚糖酶EG5AP1基因的重组载体，命名为 PPIC9 丫-e巧API。将本发明的内切葡聚糖酶基因e巧APl插入到表达载体合适的限制性酶 切位点之间，使其核巧酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选 的实施方案，优选为将本发明的内切葡聚糖酶EG5AP1插入到质粒PPIC9 丫上的EorRI和 NotI限制性酶切位点之间，使该核巧酸序列位于AOXl启动子的下游并受其调控，得到重 组质粒pPIC9 丫 -e巧API。
[0031] 本发明还提供了包含上述PPIC9 丫-e巧API基因的重组菌株，优选重组菌株为 GS115/e巧API。 阳03引本发明还提供了一种制备内切葡聚糖酶EG5AP1的方法，包括W下步骤：
[0033] 1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
[0034] 2)培养重组菌株，诱导重组纤维素酶表达；
[0035] 3)回收并纯化所表达的内切葡聚糖酶EG5AP1。
[0036] 其中，优选所述宿主细胞为毕赤酵母细胞、啤酒酵母细胞或多型逊酵母细胞，优选 将重组质粒转化毕赤酵母细胞（Pichiapasto;ris)GS115,得到重组菌株GS115/eg5APl。
[0037] 本发明还提供了上述内切葡聚糖酶EG5AP1的应用。
[0038] 内切葡聚糖酶EG5AP1具有最适溫度为75°C，最适抑为5. 0的性质，但不具备胃蛋 白酶抗性，在饲料行业中的应用受到限制。而本发明中设计的突变体在酸性条件下（pH2. 0) 能保持稳定，具有胃蛋白酶抗性，且具有更好的耐热性，因此更适于应用在饲料行业。
【附图说明】
[0039] 图1-1~图1-4显示突变前后的内切葡聚糖酶的基本性质测定结果；
[0040] 图2显示野生酶及突变酶胃蛋白酶抗性实验测定；
[0041] 图3显示野生酶与突变酶的酶活及Tm测定。<