一种热稳定性提高的肌酸水解酶突变体的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明公开了一种热稳定性提高的肌酸水解酶（Creatinase，EC3. 5. 3. 3,简称 CRE)突变体，属于酶工程领域。
【背景技术】
[0002] 肌酸水解酶是酶促检测法中检测肌酐的一种必不可少的酶，主要来源与微生物。 在一些研究中发现一些属的菌株能够通过诱导产生肌酸水解酶并在细胞中积累。这些细菌 有假单胞菌属、梭菌、黄杆菌属、芽孢菌属、产碱菌属等等。但由于原始菌的肌酸水解酶产量 很低，且诱导剂的价格较高，不适合进行工业化大规模生产。同时，对肌酸水解酶的性质分 析发现其具有底物亲和力低，热稳定性差等特点。在实际应用中就需要有大量的酶，不利于 工业生产。
[0003] 目前对肌酸水解酶性质分析比较深入的菌株主要是恶臭假单胞菌、节杆菌和产 碱杆菌。综合分析不同来源的肌酸水解酶学性质，多数肌酸水解酶的最适反应pH范围为 7. 0~8. 0,在中性、弱碱和弱酸条件下保持稳定。已报道的肌酸水解酶的最适反应温30~ 4 0 °C，而热稳定性不是很理想，在4 5 °C以下相对稳定，温度一旦高于4 5 °C，酶活会迅速下 降。因此，对肌酸水解酶的热稳定性研究很有必要。本发明通过定点突变的方式将肌酸酶 分子内部疏水性的氨基酸缬氨酸突变成疏水性强的蛋氨酸，改变了分子内部疏水性，显著 提高菌株的热稳定性，更适合工业应用。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的问题是提供一种热稳定性提高的肌酸水解酶突变体。
[0005] 所述突变体是对肌酸水解酶氨基酸序列的第368位氨基酸进行突变。
[0006] 所述肌酸水解酶氨基酸序列是SEQIDNO. 1所示的序列。
[0007] 所述肌酸水解酶核苷酸序列是SEQIDN0. 2所示的序列。
[0008] 所述肌酸水解酶来源于大肠杆菌。
[0009] 所述突变体是将第368位的缬氨酸突变为蛋氨酸，得到突变体V368M。
[0010] 本发明还提供一种表达所述突变体的基因工程菌。
[0011] 所述基于工程菌为大肠杆菌。
[0012] 所述肌酸水解酶在测定人体肌酐含量、评价人体肾脏功能中的应用。
[0013] 所述突变是对来源于大肠杆菌的肌酸水解酶蛋白质内部氨基酸进行定点突变，从 而提高了肌酸酶的热稳定性。
[0014] 有益效果：
[0015] 相对于现有的突变体V368M的半衰期提高了 5倍，其Tm值提高了 3°C。
[0016] 说明书附图
[0017] 图1 :温度对CRE活性和稳定性的影响
[0018] 图2 :突变体Tm值测定。
【具体实施方式】
[0019] LB培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl10g/L。
[0020] TB培养基：蛋白胨 12g/L、酵母粉 24g/L、甘油 10g/L、ΚΗ2Ρ04 2. 32g/L、Κ2ΗΡ04 16.43g/L〇
[0021] 采用分光光度法测定肌酸水解酶酶活。单位酶活定义：lmin内将肌酸水解产生 1ymol尿素所需要的酶量。酶活测定条件为：在试管中加入900uL肌酸溶液，在室温中平衡 5min。后加入100uL待测酶液，在37°C反应lOmin，然后向反应体系中加入2mL对-二甲胺 基苯甲醛溶液终止反应，并置于25°C温育20min，在435nm处测定吸光度值，以水调零。空白 管是在肌酸溶液中先加入对-二甲氨基苯甲醛，后加入待测酶液，其它步骤与测定管一致。
[0022] 实施例1高热稳定性突变菌株的获得
[0023] 利用定点突变试剂盒（TaKaRa)，设计一对引物（如表1所示），以已构建好的 PET20J为模板，进行PCR，将肌酸水解酶分子内部第358位的缬氨酸突变为蛋氨酸，命名 为V368M，PCR反应条件为 98°C3min，34 个循环（98°C3min、58°C30S、72°Clmin30S)、 72°C10min。PCR扩增体系：模板1μ1、上下游引物各1μl，2xPrimeStar24μ1、灭菌的双 蒸水24μ1。PCR结束后，加入5μ1的FDbuffer、1μ1的Dpnl消化lh。采用胶回收试剂 盒对消化完的PCR产物进行纯化和回收、转化。转化子有上海生工进行测序。测序正确的 转化子命名为Pet20J-V368M。
[0024] 表 1
[0025]
[0026] 实施例2高热稳定性肌酸水解酶突变株的验证
[0027] 将测序正确的质粒，转化E.coliBL21，挑选转化子接种到LB液体培养基中，37°C 培养12h，转化至TB培养基，接种量为3%。菌体长到0D600为3时，加入IPTG，使其终浓 度为0.6mmol/L，并将培养温度降到30°C，培养8h。收集发酵后的菌体。超生破碎后测定 相同温度下保温不同时间的酶活。
[0028] 实施例3肌酸水解酶的纯化
[0029] 破碎大肠杆菌后进行硫酸铵沉淀，选择55 % -75 %硫酸铵饱和度的沉淀，用少量 磷酸盐缓冲液（PH7.0)溶解蛋白沉淀，透析24h除去酶液中的硫酸铵。根据肌酸水解酶的 等电点性质，选择QFF柱进行离子交换纯化。QFF柱以磷酸盐缓冲液平衡30min，将粗酶液 注入纯化柱中，用含有1MNaCl的磷酸缓冲液洗脱目的蛋白。
[0030] 实施例4肌酸水解酶纯酶液性质测定
[0031] 将纯化后的肌酸水解酶稀释，测定在50°C下保温0、5、15、20、25、30min的残余酶 活。发现Pet20J(WT)在保温10min后其残余酶活仅为8. 3%，而突变体pET20J-V368M保 温10min后其残余酶活为76. 4% (如图1所示）。通过计算，WT的半衰期为2. 3min，而突 变体V368M的半衰期为11. 6min，提高了 5倍。其次，用DSC测其Tm值，突变体较WT提高了 3°C(如图2所示）。
[0032] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技 术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范 围应该以权利要求书所界定的为准。
【主权项】
1. 一种热稳定性提高的突变体，其特征在于：所述突变体是将肌酸水解酶氨基酸序列 的第368位氨基酸突变成蛋氨酸。2. 根据权利要求1所述的一种热稳定性提高的突变体，特征在于，所述肌酸水解酶氨 基酸序列是SEQIDNO. 1所示的序列。3. 根据权利要求1所述的一种热稳定性提高的突变体，特征在于，所述肌酸水解酶核 苷酸序列是SEQIDNO. 2所示的序列。4. 根据权利要求1或2所述的一种热稳定性提高的突变体，特征在于，所述肌酸水解酶 来源于大肠杆菌。5. 根据权利要求1所述的一种热稳定性提高的突变体，特征在于，所述突变体是将第 368位的缬氨酸突变为蛋氨酸，得到突变体V368M。6. 能够表达权利要求1所述突变体的基因工程菌。
【专利摘要】本发明公开了一种热稳定性提高的肌酸水解酶突变体，属于酶工程领域，所述突变体是对肌酸水解酶氨基酸序列的第368位氨基酸进行突变。所述肌酸水解酶来源于大肠杆菌。所述突变体是将第368位的缬氨酸突变为蛋氨酸，得到突变体V368M。所述突变是对来源于大肠杆菌的肌酸水解酶蛋白质内部氨基酸进行定点突变，从而提高了肌酸酶的热稳定性。相对于现有的突变体V368M的半衰期提高了5倍，其Tm值提高了3℃。
【IPC分类】C12N1/21, C12N9/78, C12R1/19
【公开号】CN105274080
【申请号】CN201510766758
【发明人】陈坚, 刘松, 阮洁, 冯岳, 李江华, 陈双全, 邱芳芳, 王晨蕾
【申请人】江南大学
【公开日】2016年1月27日
【申请日】2015年11月11日