一种有效提高Nisin热稳定性的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物防腐剂生产技术领域，涉及一种Nisin的抑菌防腐制剂，无论应用于酸性食品环境，还是应用于中性或偏碱性食品环境中，在同食品高温消毒下，均可有效提高Nisin其热稳定性，使其依然具有有效的抑菌活性的方法。
【背景技术】
[0002]Nisin作为全球范围内较为绿色和安全的生物防腐剂之一，它不仅具有良好的抑菌作用，而且它可以能通过人体的蛋白酶消化和降解作用而被吸收，具有良好的生物相容性。目前，Nisin在食品和医药领域均有较为广泛的应用范围和发展趋势。然而，Nisin在同食品进行高温或高温高压等工艺处理后，Nisin的热稳定性会有部分降低。特别是在pH大于等于6的偏酸性、中性或偏碱性的食品基质环境中，Nisin热稳定性大幅降低。当pH超过4时，特别是加热条件下，它在水溶液中的分解速度加快，热稳定性降低:如在pH等于5.0时，灭菌后丧失40%活力；pH等于6.8时，灭菌后丧失90%活力。
[0003]这主要是由于Nisin氨基酸序列中不饱和氨基酸如DHB2，DHA5和DHA33的不完整性使得其生物活性随着外界温度、pH变化等而严重损失，在低pH值下，DHA双键与水分子相互结合，形成相应的氨基化合物和酮酸，不影响其抑菌活性，但随着pH值的增加，在碱性条件下，随着亲和性物质结合不饱和氨基酸的双键，导致了 Nisin分子间的聚合作用，从而使得其溶解度和抑菌活性的降低，若温度升高，Nisin的活性损失更加严重。许多研究应用微胶囊包埋技术，将Nisin包埋进微型胶囊中，发挥防腐剂缓释的作用，同时抵抗外界高温高压以及酶解作用。但其方法较难工业化。通过检索，发现与本专利申请相关的专利公开文献主要有:
[0004]专利号为:ZL201310337300.4的“一种乳酸链球菌素复合生物防腐剂及其制备方法”其保护点在于:利用壳聚糖、竹叶抗氧化物、六偏磷酸钠、纳他霉素、大蒜素、抗坏血酸钠、麦芽糊精以及NaCl对Nisin起到协同保护作用，克服了单纯的乳酸链球菌素抗菌谱窄和低pH值依赖性的局限。但其抑菌的增效特点是通过复配防腐剂的多种成分共同作用来实现的，而并非提高nisin自身的抑菌谱以及pH应用范围，Nisin自身的抑菌范围以及pH应用范围并没有提高。例如利用纳他霉素、竹叶抗氧化物等来提高其复合防腐剂的抑菌广谱性，利用纳他霉素等自身pH适用范围广的特点来弥补Nisin适用范围较窄的特点。而本专利重点利用1丐盐等提高Nisin自身热稳定性，扩大Nisin自身的pH应用范围，使Nisin自身具有较宽的pH应用范围，可以在非低酸性环境中具有较高的热稳定性。
[0005]专利号为:ZL201410016022.7的“一种乳酸链球菌素微乳液”，其保护点在于:利用调和油、曲拉通X-100、95%乙醇、吐温80、十六烷基三甲基溴化铵和纯净水等成分，经超声波超声和高压均质处理后，提高了乳酸链球菌素的溶解性，得到具有较好稳定性的微乳液，该微乳液具有良好的抑制枯草芽孢杆菌的性能，还能够抑制革兰氏阴性菌如大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。此专利重点突出提高Nisin的溶解性，以及提高其抑菌谱。而本专利重点在于提高的Nisin在不同pH环境下的适用性，特别是非低酸性环境下的热稳定性。
[0006]专利号为:201110407688.1的“一种含有薄荷油的纳米抗菌乳液及其制备方法”，主要利用薄荷油、中链甘油三酸酯、乳化剂、水等组分制备而成的。此专利主要克服了由于薄荷油密度低引起的乳状液分层现象，并通过高压均质制备得到稳定的纳米乳液体系，增加抑菌效果，延长货架期。而本专利是通过豆油、聚乙二醇以及高压匀质作用，同时提高Nisin的溶解性以及其与含有脂类食物的相容性。与此同时，更加注重Nisin的热稳定性，提高其在高温烹调或灭菌过程中的热稳定性，以提高其在食品中的实际应用性。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是针对以上技术中所存在的问题，提供了一种热稳定好，成本低廉，可以承受高压高热的Nisin乳化液的制备方法，本法制备的Nisin乳化液及其干粉抑菌稳定性好、热稳定好，可以大大满足低酸性或中性食品在高温灭菌条件下保留抑菌剂抑菌活力，从而延长货架期的要求。
[0008]本发明实现目的的技术方案如下:
[0009]—种有效提高Nisin热稳定性的方法，通过在Nisin发酵前的培养基中，或发酵过程中的培养基中，或发酵结束后获得的发酵液中添加钙盐，然后再经乳化处理获得Nisin乳化液。
[0010]而且，所述钙盐为氯化钙、碳酸钙、乳酸钙中一种或几种的混合物。
[0011]而且，在发酵液后处理过程中加入添加豆油和聚乙二醇。
[0012]—种热稳定性高的Nisin浓缩乳化液的制备方法，步骤如下:⑴待发酵结束后，用HC1调节发酵液pH为2.0?2.5，之后将发酵液升温至75?90°C，持续20?30min，之后迅速冷却至室温；
[0013]⑵将步骤⑴冷却至室温的发酵液先采用滤布或膜过滤除掉大颗粒物质、菌体以及不溶物，得到初滤液，再将初滤液用孔径为0.45 μπι的微滤膜进行微滤处理，将微滤后的滤清液利用截留分子量为lKDa的超滤系统对Nisin进行超滤去除小分子物质，得到纯化后的Nisin截留液；
[0014]⑶将超滤纯化后的Nisin截留液经过卷式纳滤膜，纳滤除盐、浓缩，得到Nisin浓缩液；
[0015]⑷向纳滤后得到的Nisin浓缩液中添加浓度为0.05?4.0% (g/100ml)的钙盐，在室温25°C条件下，保持转速200?400r/min，10?20min，混合均匀后，用NaOH调节浓缩液pH值至3?6 ;
[0016](5)向步骤⑷处理后的浓缩液中添加0.02?0.1% (g/100ml)羟丙基-β环糊精、0.25?0.8% (g/100ml)豆油、0.01?0.1% (g/100ml)聚乙二醇，利用高速勾楽机，低温搅拌20?30min，再利用高压均质器进行均质乳化，最终得到提高热稳定性的Nisin乳化液；
[0017]所述钙盐为氯化钙、碳酸钙、乳酸钙中一种或几种的混合物。
[0018]—种热稳定性高的Nisin浓缩干粉，将权利要求4得到的Nisin浓缩乳化液干燥，制备Nisin乳化干粉，干燥采用的方法为喷雾干燥、沸腾干燥或冷冻干燥。
[0019]—种热稳定性高的Nisin浓缩乳化液的制备方法，步骤如下:⑴在发酵前，向发酵培养基中添加0.05?4.0% (g/100ml)钙盐，混合均匀后，经高温灭菌，转接1 %?6%种子液，30?37°C静置培养8?15h ;
[0020]⑵待发酵结束后，用HC1调节发酵液pH为2.0?2.5，之后将发酵液升温至75?90 °C，持续20?30min，之后迅速冷却至室温；
[0021]⑶将步骤⑵冷却至室温的发酵液先采用滤布或膜过滤除掉大颗粒物质、菌体以及不溶物，得到初滤液，再将初滤液用孔径为0.45 μ m的微滤膜进行微滤处理，得到微滤后的滤清液；
[0022]⑷用NaOH调节步骤(3)得到的微滤后滤清液pH至3?6 ;
[0023](5)向步骤⑷处理后的浓缩液中添加0.02?0.1% (g/100ml)羟丙基-β环糊精、0.25?0.8% (g/100ml)豆油、0.01?0.1% (g/100ml)聚乙二醇，利用高速勾楽机，低温搅拌20?30min，再利用高压均质器进行均质乳化，最终得到提高热稳定性的Nisin乳化液；
[0024]所述钙盐为氯化钙、碳酸钙、乳酸钙中一种或几种的混合物。
[0025]—种热稳定性高的Nisin浓缩干粉，将上述得到的Nisin浓缩乳化液干燥，制备Nisin乳化干粉，干燥采用的方法为喷雾干燥、沸腾干燥或冷冻干燥。
[0026]—种热稳定性高的Nisin浓缩乳化液的制备方法，步骤如下:⑴在发酵过程中的1?14h，向发酵培养基中添加0.05?4.0% (g/100ml)钙盐，混合均匀后，继续静置培养至发酵结束；
[0027]⑵将步骤⑴冷却至室温的发酵液先采用滤布或膜过滤除掉大颗粒物质、菌体以及不溶物，得到初滤液，再将初滤液用孔径为0.45 μπι的微滤膜进行微滤处理，将微滤后的滤清液利用截留分子量为lKDa的超滤系统对Nisin进行超滤去除小分子物质，得到纯化后的Nisin截留液；
[0028]⑶将步骤⑵冷却至室温的发酵液先采用滤布或膜过滤除掉大颗粒物质、菌体以及不容物，得到初滤液，再将初滤液用孔径为0.45 μ m的微滤膜进行微滤处理，得到微滤后的滤清液；
[0029]⑷向步骤⑶处理后的浓缩液中添加0.02?0.1% (g/100ml)羟丙基-β环糊精、0.25?0.8% (g/100ml)豆油、0.01?0.1% (g/100ml)聚乙二醇，利用高速勾楽机，低温搅拌20?30min，再利用高压均质器进行均质乳化，得到提高热稳定性的Nisin乳化液；
[0030]所述钙盐为氯化钙、碳酸钙、乳酸钙中一种或几种的混合物。
[0031]—种热稳定性高的Nisin浓缩干粉，将权利要求8得到的Nisin浓缩乳化液干燥，制备Nisin乳化干粉，干燥采用的方法为喷雾干燥、沸腾干燥或冷冻干燥。
[0032]本发明取得的优点和有益效果是:
[0033]本发明研发一种在实际应用中能够充分拓展Nisin的应用范围，提高Nisin在pH在4?8区间内经高温灭菌的热稳定性，并能在食品中起到长效抑菌的作用。利用钙离子对Nisin在应用pH环境在4?8区间内，起到热稳定性的保护作用，所制备的交联钙离子的Nisin能够克服Nisin应用范围受限的不利因素。与此同时，利用豆油以及聚乙二醇，增强Nisin的可溶性以及乳化性，使其均匀分布于食品