一种底物特异性提高的胆固醇氧化酶突变体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种底物特异性提高的胆固醇氧化酶突变体及其应用，属于酶工程技 术领域。
【背景技术】
[0002] 胆固醇氧化酶（Cholesteroloxidase;EC1. 1. 3. 6 ;C0D)属于黄素氧化酶类，能特 异性氧化含C3-0H的类固醇底物，为催化胆固醇降解的第一步作用酶，氧化胆固醇C3-0H， 随后异构化类固醇环上A5-6双键，其中以氧气为电子受体生成胆留-4-烯-3-酮和H202。
[0003] 胆固醇氧化酶具有重要医学检测价值，可用于定量血样胆固醇的含量，如动脉粥 样硬化性疾病需评估高密度脂蛋白或低密度脂蛋白的含量，以及评估血栓形成的风险等， 而将胆固醇氧化酶固定在膜上采用电化学生物传感器测定胆固醇的含量是最近研究的热 潮；胆固醇氧化酶具有广泛的底物特异性，可以转化大量的3β-羟留类化合物，同时伴随 有异构化作用，为工业类固醇药物留体激素或留体类药物的合成生产提供有用的中间体。 例如R.equiDSM89-133被用来转化胆固醇和其他的留醇生产雄留-4-烯-3, 17-二酮和雄 甾-1，4-二烯-3, 17-二酮。胆固醇氧化酶在生物催化方面的应用前景广阔，要求胆固醇氧 化酶具有不同的底物特异性。
[0004] 胆固醇，谷留醇，孕烯酮醇，胆留烷醇是四种胆固醇氧化酶常见的底物，它们有相 同的环结构，差异在于R侧链不同。在生物催化生产类固醇药物前体物质需要胆固醇作用 于不同侧链的类固醇。
[0005] 为了提高胆固醇氧化酶的应用价值，对酶分子改造主要是改变底物特异性。 Nishiya采用随机突变的方式找到V145E/G405S突变株能提高Km值并适于临床检测胆固醇 含量；也有报道对StreptomycesSA-COO源CODs进行突变，发现突变酶对脱氧异雄酮的催化 效率提高了，对囊泡胆固醇的催化效率降低了，这可能是因为突变损坏酶的疏水通道，破坏 对疏水活性中心的保护。
[0006] 目前，还鲜有关于提高胆固醇氧化酶对孕烯酮醇的特异性的报道。
【发明内容】
[0007] 为了解决上述问题，本发明提供了一种对孕烯酮醇底物特异性提高的胆固醇氧化 酶突变体。
[0008] 所述突变体的氨基酸序列是在NCBI上GenBank:ABC75776. 1的胆固醇氧化酶氨基 酸序列的基础上，缺失了第125位至第128位的氨基酸。
[0009] 在本发明的一种实施方式中，所述突变体，是在Rhodococcussp.源（以前被分类 命名为Brevibacteriumsp.DGCDC-82)的胆固醇氧化酶基础上进行氨基酸删除突变得到 的。
[0010] 在本发明的一种实施方式中，所述Rhodococcussp.源的胆固醇氧化酶（CODr)的 氨基酸序列，GenBank:ABC75776. 1〇
[0011] 在本发明的一种实施方式中，所述Rhodococcussp.源的CODr的核苷酸序列，如 Genebank:DQ345780. 1〇
[0012] 所述突变体对孕烯酮醇的底物特异性提高了 5倍。
[0013] 本发明还要求保护表达所述突变体的载体、工程菌，以及所述突变体在食品、环 境、制备药物等方面的应用。
[0014] 本发明还提供一种提高Rhodococcussp.源的胆固醇氧化酶底物特异性的方法， 所述方法是对Rhodococcussp.源的胆固醇氧化酶进行氨基酸删除突变。
[0015] 在本发明的一种实施方式中，所述方法是删除Rhodococcussp.源的胆固醇氧化 酶的第125位至第128位的氨基酸。
[0016] 本发明的有益效果：
[0017] 原始的Rhodococcussp.源的胆固醇氧化酶对胆固醇，谷留醇，孕稀酮醇，胆甾烧 醇这4种底物的活性差不多，而本发明的突变体CODr-ΜΙ的底物特异性有显著变化，对孕烯 酮醇的活性最高，是对胆固醇的活性的5. 3倍。通过本发明的方法，有效提高了胆固醇氧化 酶对底物孕烯酮醇的特异性。
【附图说明】
[0018] 图1 :底物结构式；
[0019] 图2 :底物特异性比较。
【具体实施方式】
[0020] 实施例1 :突变株的构建
[0021] (1)化学合成CODr基因片段，序列如GenBank登录号为DQ345780. 1(Rhodococcus sp.来源的胆固醇氧化酶）所示，将该基因片段连接到pET28a(+)，转化E.coli。提取重组 E.coli，质粒，验证正确的质粒，即为重组质粒pET28a(+)_C0Dr。
[0022] (2)以pET28a(+)-CODr为模板，PriMl(cagccggtcagcaacggcatcaacaagagc，序列 如SEQIDN0.1)为引物进行PCR，根据全质粒扩增突变原理，用quickcutDpnI消化PCR 产物，去除模板质粒。得到相对于GenBank:ABC75776. 1的胆固醇氧化酶的第125位至128 位氨基酸发生缺失的突变质粒pET28a(+) -CODr-ΜΙ。
[0023] (3)将pET28a(+)-C0Dr-Ml转化得到大肠杆菌Ε·coliBL21 (DE3)中，验证重组 转化子，验证正确的即为突变体菌株E.coli-CODr-Ml，突变体菌株所产胆固醇氧化酶即为 CODr-ΜΙ〇
[0024] 实施例2 :突变株发酵产酶与酶纯化
[0025] (1)粗酶液的制备
[0026] 种子液的培养条件：采用250mL摇瓶培养，装液为20%的LB培养基，并在培养基 中加入过滤除菌的l〇〇mg·mL1硫酸卡那霉素50yL，取单菌落至培养基中，37°C，200rpm， 过夜培养。
[0027] 发酵液培养条件：采用500mL摇瓶培养，装液为20 %的发酵培养基，其中的 MgS04 · 7H20,葡萄糖，甘油分别配成母液，单独灭菌，用时添加相应的量，并加入过滤除菌 100mg·mL1的硫酸卡那霉素100μL，加入5 %的种子液，37°C，200rpm，培养8h，加入20 % 的乳糖诱导液，28°C，200rpm，诱导培养20h。
[0028] 菌体的收集及粗酶液的获得：将发酵液8000rpm离心5min，称得湿重，按lg湿菌 体加入20mLpH7. 5,20mmol·mL1的磷酸缓冲液的比例重悬菌体，进行超声破碎，使用过程 破壁4min，停lmin，并吹打菌液，防止破壁过程中因温度过高导致酶的失活，破壁30min后 8000rpm离心lOmin，上清即为粗酶液。
[0029] (2)COD的纯化
[0030] 以琼脂糖为基质，2-羟基-1，3-丙二胺连接臂，8-氯咯嗪为配体合成的介质进行 亲和纯化。
[0031] 1.样品制备：将上样粗酶液的的电导率与20mmol*L1磷酸缓冲液（pH7. 5)的电 导率调节到一致。
[0032] 2.装柱：15mL塑料小柱垂直固定，柱子下端导管打开，装入3mL介质，静置沉淀，使 柱中乙醇流出约至略高出介质界面。
[0033] 3.平衡：用20mmol·L1磷酸缓冲液（pH7. 5)平衡10个柱体积。
[0034] 4.上样：取20mL粗酶液加到平衡好的亲和介质中。
[0035] 5.洗涤：用20mmol*L1磷酸缓冲液（pH7. 5)洗10个柱体积，洗去未结合的蛋白， 再用含0.lmol·LWaCl的磷酸缓冲液（pH7. 5)洗去部分与介质结合不牢固的杂蛋白。
[0036] 6.洗脱：以含0. 5mol*LWaCl的磷酸缓冲液（pH7. 5)为洗脱液，收集并测定C0D 活性用SDS-PAGE检测蛋白的分子量大小和纯度。
[0037] 实施例3 :突变前后胆固醇氧化酶的底物特异性比较
[0038] 选取胆固醇，谷甾醇，孕烯酮醇，胆甾烷醇四种底物（结构式如图1所示），都配成 21. 3mmol·L1的检测液B，测定酶活，并以胆固醇为底物时的活性为100%，计算以其他类 固醇为底物时的相对活性，比较酶的底物特异性。
[0039] C0D酶活的测定：
[0040] 利用胆固醇氧化酶与辣根过氧化物酶的耦合反应，胆固醇氧化酶氧化类固醇底物 产生的H202，可以在辣根过氧化酶的作用下使苯酚与4-氨基-安替比林产生红色苯醌亚胺 类化合物，在A500处有最大吸收峰。具体操作：比色管中加入3mL检测液A(4-氨基-安 替比林，lmmol/L;苯酸，6mmol/L;叠氮钠，0. 2g/L;过氧化物酶，5, 000U/L;磷酸钾缓冲 液，25mmol/L，pH7. 5) +50uL酶液+150uL类固醇底物（异丙醇为溶剂），三种组分振荡混匀 后，37°C水浴15min，立即用沸水煮3min，使酶失活，放冷水中冷却；9000rpm，离心2min;上 清A500处测吸光值，平行实验测三次，取平均值。酶活标准曲线的测定参见文献（陈亦.胆 固醇氧化酶亲和纯化及酶稳定性研究〔D〕.无锡.江南大学.2013)。酶活力单位定义：在 37°C下，每分钟催化1μmol类固醇底物转化成产物所需的酶量定义为1个酶活力单位（U)。
[0041] 结果如图2所示。结果显示，原酶（wild-type)对4种底物的活性差不多，对孕 烯酮醇的活性稍好，C0Dr-M2(在129G和1301之间插入丙氨酸）对四种底物的特异性跟原 酶相似，CODr-Ml的底物特异性有显著变化，对孕烯酮醇的活性最高，是对胆固醇的活性的 5. 3倍。这可能是由于突变后胆固醇氧化酶的结构发生变化，限制了lid区与带有较长侧 链底物的接触，而便于与带有较短侧链的留醇（比如孕烯酮醇）接触、作用。本发明的突变 体，改变酶的底物特异性，对孕烯酮醇的活性较好。
[0042] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技 术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范 围应该以权利要求书所界定的为准。
【主权项】
1. 一种胆固醇氧化酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列是在NCBI上 GenBank:ABC75776. 1的胆固醇氧化酶氨基酸序列的基础上，缺失了第125位至第128位的 氨基酸。2. 编码权利要求1所述突变体的核苷酸序列。3. 表达权利要求1所述突变体的基因工程菌。4. 根据权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是以大肠杆菌为 宿主而得到的。5. 权利要求1所述突变体在食品、环境或制备药物方面的应用。6. -种提高Rhodococcussp.源的胆固醇氧化酶的底物特异性的方法，其特征在于， 所述方法是在Rhodococcussp.源的胆固醇氧化酶的基础上，缺失其氨基酸序列的第125 位至第128位。7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述Rhodococcussp.源的胆固醇氧化酶 是NCBI上GenBank:ABC75776. 1所示的胆固醇氧化酶。
【专利摘要】本发明公开了一种底物特异性提高的胆固醇氧化酶突变体及其应用，属于酶工程技术领域。本发明的突变体，是在Rhodococcus？sp.源(以前被分类命名为Brevibacterium？sp.DGCDC-82)的胆固醇氧化酶的基础上进行氨基酸删除突变得到的。原始的Rhodococcus？sp.源的胆固醇氧化酶对胆固醇，谷甾醇，孕烯酮醇，胆甾烷醇这4种底物的活性差不多，而本发明的突变体CODr-M1的底物特异性有显著变化，对孕烯酮醇的活性最高，是对胆固醇的活性的5.3倍。通过本发明的方法，有效提高了胆固醇氧化酶对底物孕烯酮醇的特异性。
【IPC分类】C12N15/53, A23L33/18, A61K38/44, C12N1/21, C12N9/04
【公开号】CN105274071
【申请号】CN201510788289
【发明人】张玲, 杨海麟, 辛瑜, 王武, 袁晔
【申请人】江南大学
【公开日】2016年1月27日
【申请日】2015年11月17日