一种细胞色素p450酶的特异性探针底物组合物及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种细胞色素P450(CYP450)酶的特异性探针底物组合物及其在细胞色素P450酶亚型酶活检测中的应用，所述组合物由非那西丁、香豆素、安非他酮、右美沙芬、双氯酚酸和睾酮中的至少两种组成，通过所述特异性探针底物组合物和液相色谱-质谱联用技术可以同时检测多离子通道的特性，同时间测定6种CYP450酶的抑制情况，极大地提高了实验通量效率，降低了实验成本。
【专利说明】一种细胞色素 P450酶的特异性探针底物组合物及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及酶学和生物分析【技术领域】，具体涉及一种特异性探针底物组合物及其 应用，尤其涉及一种细胞色素 P450酶的特异性探针底物组合物及其在细胞色素 P450酶亚 型酶活检测中的应用。
【背景技术】
[0002] 细胞色素 P450(CYP450)酶分布于肝脏、小肠和肾脏，其中CYP1A2、2A6、2B6、2C8、 2C9、2C19、2D6、2E1和3A4等亚型与外源性物质（如药物）代谢清除密切相关，参与90%的 药物代谢。在新药研发过程中，可以通过这些CYP450酶的探针底物在体外代谢体系（如人 肝微粒体等）生成特异性代谢产物的速率，判断药物是否会抑制特定的CYP酶亚型，进而推 断该药物是否会引起体内药物间相互作用，降低药效或增加毒性。
[0003] 近年来，对高通量药物筛选的需求日益增加，目前，用于研究CYP活性的方法主要 中，"cocktail"探针药物法较为常见，但其仍有很多不足之处，如构成该cocktail的几种 药物在共同孵育时可能存在着相互作用，而且对分析方法的灵敏度和特异性要求较高，这 样就会提高分析成本。
[0004] 随着组合化学和高通量筛选手段的采用，需要进行CYP450酶抑制作用筛选的化 合物急剧增多，而目前由于分析方法（如高效液相、紫外或荧光）的灵敏度限制，每次分析 仅能预测化合物对单个酶的抑制作用，耗时低效。
[0005] 因此，寻找一种可靠的混合探针底物和高灵敏度的分析方法是目前亟待解决的问 题。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种特异性探针底物组合物及其应用，特别是一种细胞色 素 P450酶的特异性探针底物组合物及其在细胞色素 P450酶亚型酶活检测中的应用。
[0007] 为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
[0008] 第一方面，本发明提供了一种细胞色素 P450(CYP450)酶的特异性探针底物组合 物由非那西丁、香豆素、安非他酮、右美沙芬、双氯酚酸和睾酮中的至少两种组成。本发明的 特异性探针底物组合物例如可以是：非那西丁与香豆素、安非他酮、右美沙芬、双氯酚酸或 睾酮中任意一种或至少两种的组合，或者，香豆素与非那西丁、安非他酮、右美沙芬、双氯酚 酸或睾酮中任意一种或至少两种的组合等等，优选为非那西丁、香豆素、安非他酮、右美沙 芬、双氯酚酸和睾酮的组合物。
[0009] 其中，所述非那西丁的浓度为7. 5-30 μ M，例如可以是：7. 5 μ M、8. 5 μ M、10. 5 μ M、 12. 5 μ Μ、15 μ Μ、18 μ Μ、20 μ Μ、23 μ Μ、25 μ Μ、30 μ Μ，优选为 15-25 μ Μ，更优选为 15 μ Μ。
[0010] 所述香豆素的浓度为1.25-5以]?，例如可以是1.25以]\1、1.5以]\1、2.(^]\1、2.25 4]\1、 2·5μΜ、2·75μΜ、3μΜ、3·5μΜ、4μΜ、4·5μΜ、5μΜ，优选为 1·25-3·5μΜ，更优选为 2· 5 μ Μ。
[0011] 所述安非他酮的浓度为2. 5-10μΜ，例如可以是2. 5μΜ、3μΜ、3. 5μΜ、4μΜ、 4· 75μΜ、5μΜ、5· 25μΜ、6· 5μΜ、7μΜ、7· 5μΜ、8μΜ、8· 25μΜ、8· 5μΜ、9μΜ、9· 5μΜ、 10 μ Μ，优选为3. 5-8 μ Μ，更优选为5 μ Μ。
[0012] 所述右美沙芬的浓度为2. 5-10μΜ，例如可以是2. 5μΜ、3μΜ、3. 5μΜ、4μΜ、 4· 5 μ Μ、5 μ Μ、5· 25 μ Μ、6· 5 μ Μ、7 μ Μ、7· 5 μ Μ、8 μ Μ、8· 25 μ Μ、8· 5 μ Μ、9 μ Μ、9· 5 μ Μ、10 μ Μ, 优选为3. 5-8 μ Μ，更优选为5 μ Μ。
[0013] 所述双氯酚酸的浓度为2. 5-10μΜ，例如可以是2. 5μΜ、3μΜ、3. 5μΜ、4μΜ、 4· 5 μ Μ、5 μ Μ、5· 25 μ Μ、6· 5 μ Μ、7 μ Μ、7· 5 μ Μ、8 μ Μ、8· 25 μ Μ、8· 5 μ Μ、9 μ Μ、9· 5 μ Μ、10 μ Μ, 优选为3. 5-8 μ Μ，更优选为5 μ Μ。
[0014] 所述睾酮的浓度为5-20μΜ，例如可以是5μΜ、6· 5μΜ、8μΜ、10μΜ、12μΜ、 15 μ Μ、16 μ Μ、17 μ Μ、18 μ Μ、20 μ Μ，优选为 8-18 μ Μ，更优选为 10 μ Μ。
[0015] 第二方面，本发明还提供了如本发明第一方面所述的特异性探针底物组合物在检 测细胞色素 Ρ450酶6种亚型酶活性的应用。
[0016] 本发明的细胞色素 Ρ450酶可以是来源于肝、肾和胃肠道等含有Ρ450酶的细胞和 亚细胞器，如肝细胞、微粒体和S9等。
[0017] 作为优选技术方案，本发明的应用包括利用如本发明第一方面所述的特异性探针 底物组合物检测细胞色素 Ρ450酶6种亚型的抑制作用。
[0018] 在进行检测时，可以结合液相色谱-质谱联用技术同时进行，或者采用高效液相 色谱等检测手段，都可以实现对细胞色素 Ρ450酶6种亚型的抑制作用。
[0019] 作为优选技术方案，本发明的检测方法包括以下步骤：
[0020] (1)将所述的特异性探针底物组合物同时与肝微粒体在体外进行孵化反应；
[0021] (2)采用液相色谱-质谱分析方法同时测定所述的特异性探针底物组合物及其生 成的对应的6种代谢产物；
[0022] (3)选择6种细胞色素 Ρ450酶的特异性抑制剂加入到其所对应酶的单个探针底物 及混合探针底物的反应体系中，测定生成的代谢物，计算相应IC50值。
[0023] 优选地，所述孵化时间为5_20min，例如可以是5min、6min、7min、8min、9min、 lOmin、12min、14min、15min、16min、18min、20min,优选为 7_15min,更优选为 10min〇 优选 地，步骤（2)所述的代谢产物为对乙酰氨基酚、羟基香豆素、羟基安非他酮、右羟吗喃、4-羟 基双氯酚酸和6 β -羟基睾酮。
[0024] 本发明的肝微粒体包括但不限于人源性的，还包括大鼠、小鼠、狗、猴、树駒等灵长 类动物，优选为人肝微粒体。
[0025] 第三方面，本发明还提供了如本发明第一方面所述的特异性探针底物组合物制成 药学上可接受的制剂。
[0026] 作为优选技术方案，所述的制剂为溶液剂。
[0027] 第四方面，本发明还提供了如本发明第一方面所述的特异性探针底物组合物在制 备测定肝药酶活性药物的应用。
[0028] 第五方面，本发明还提供了如本发明第三方面所述的制剂在制备测定肝药酶活性 药物的应用。
[0029] 与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
[0030] 本发明采用的6种混合CYP450酶探针底物，特异性强，任一探针底物均可被目标 细胞色素 P450高特异性地代谢成为相应的单羟化产物；相互间的干扰低，实现了在一个样 品中多个反应互不干扰，可用于检测待测物对多个酶的抑制情况；
[0031] 此外，本发明采用液相色谱-质谱联用技术进行定量分析，提高了实验通量效率， 大大节约了检测的成本和时间，而且更接近肝组织代谢过程，更好地模拟了肝酶代谢环境。
【专利附图】
【附图说明】
[0032] 图1是本发明的特异性探针底物组合物与单独底物1A2对各CYP450酶的产物-时 间曲线图。
[0033] 图2是本发明的特异性探针底物组合物与单独底物2A6对各CYP450酶的产物-时 间曲线图。
[0034] 图3是本发明的特异性探针底物组合物与单独底物2B6对各CYP450酶的产物-时 间曲线图。
[0035] 图4是本发明的特异性探针底物组合物与单独底物3A4对各CYP450酶的产物-时 间曲线图。
[0036] 图5是本发明的特异性探针底物组合物与单独底物2D6对各CYP450酶的产物-时 间曲线图。
[0037] 图6是本发明的特异性探针底物组合物与单独底物2C9对各CYP450酶的产物-时 间曲线图。
【具体实施方式】
[0038] 下面通过【具体实施方式】来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明 了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
[0039] 实施例1筛诜特异件强的CYP450酶探针底物
[0040] (1)分别测定CYP450酶和其常用的探针底物间的酶动力学参数，结果如表1所示， 作为挑选探针底物的参考和依据。
[0041] 表 1
[0042]
【权利要求】
1. 一种细胞色素 P450(CYP450)酶的特异性探针底物组合物，其特征在于，所述组合物 由非那西丁、香豆素、安非他酮、右美沙芬、双氯酚酸和睾酮中的至少两种组成；其中，非那 西丁的浓度为7. 5-30 μ M，香豆素的浓度为1. 25-5 μ M，安非他酮的浓度为2. 5-10 μ M，右美 沙芬的浓度为2. 5-10 μ Μ，双氯酚酸的浓度为2. 5-10 μ Μ，睾酮的浓度为5-20 μ Μ。
2. 根据权利要求1所述的特异性探针底物组合物在检测细胞色素 Ρ450酶6种亚型酶 活性中的应用。
3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的应用包括采用权利要求1所述的特 异性探针底物组合物检测细胞色素 Ρ450酶6种亚型的抑制作用； 优选地，采用权利要求1所述的特异性探针底物结合液相色谱-质谱联用技术或高效 液相色谱技术检测细胞色素 Ρ450酶6种亚型的抑制作用。
4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的检测方法包括以下步骤： (1) 将所述的特异性探针底物组合物同时与肝微粒体在体外进行孵化反应； (2) 采用液相色谱-质谱分析方法同时测定所述的特异性探针底物组合物及其生成的 对应的6种代谢产物； (3) 选择6种细胞色素 Ρ450酶的特异性抑制剂加入到其所对应酶的单个探针底物及混 合探针底物的反应体系中，测定生成的代谢物，计算相应IC50值； 优选地，所述孵化时间为5-20min，优选为lOmin。
5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤（2)所述的代谢产物为对乙酰氨基 酚、7-羟基香豆素、羟基安非他酮、去甲右美沙芬、4-羟基双氯酚酸和6 β -羟基睾酮。
6. 根据权利要求1所述的特异性探针底物组合物制成药学上可接受的制剂。
7. 根据权利要求6所述的制剂，其特征在于，所述的制剂为溶液剂。
8. 根据权利要求1所述的特异性探针底物组合物在制备测定肝药酶活性药物的应用。
9. 根据权利要求6所述的制剂在制备测定肝药酶活性药物的应用。
【文档编号】C12Q1/26GK104195218SQ201410446334
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年9月3日 优先权日:2014年9月3日
【发明者】张素行, 张飞鹏, 叶沛珍, 陈涛, 龙娜, 张科之, 黄晓勇 申请人:广东中西达一新药开发有限公司