细胞色素氧化酶cyp1a的比率型荧光探针底物及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药技术领域，具体设及一种细胞色素氧化酶CYPlA的比率型巧 光探针反应及其应用。
【背景技术】
[0002] 细胞色素P450酶系（巧toe虹omeP450,P450酶）超家族是机体内最重要的药物 代谢酶，大约60%的药物（包括绝大部分临床药物和杀虫剂）的主要清除是由CYP介导的。 细胞色素P450酶系是一个蛋白质超家族，是一大类含血红素的蛋白质，在还原态时与CO形 成的复合物于450nm处有最大吸收峰。因其催化的I相反应是化合物在体内代谢的关键步 骤，因为运一步反应通常是药物从体内清除的限速步骤，可影响化合物的半衰期、清除率等 动力学特征，且P450酶活性常随遗传因素、年龄、疾病状态或其它药物相互作用的影响而 发生改变。药物对机体P450酶的影响，能造成临床上显著的药物相互作用。
[0003] CYPlA是重要的I相代谢酶，主要包括两种亚型：CYP1A1和CYP1A2,其中CYPlAl主 要在人肺中表达，而CYP1A2则主要在人肝中表达，且占人肝中CYP总量的13%。CYPlA也 参与多种药物例如茶碱、咖啡因、安替比林等，W及环境毒素和内源性底物的代谢，并在多 种前致癌物被激活成具有遗传毒性中间体或最终致癌物的过程中起到了重要作用，例如 在一定程度上激活咖啡因诱使肝硬化的发生（M0LASPECTSME化1999. 20 :1-137)。除此之 夕bCYPlA的活性在不同人种中也有很大的个体差异，人口研究发现CYPlA在不同人种中可 能会呈现单峰、双峰甚至S峰的分布巧urJClin化armacol. 1995. 47:423-430)。因此，开 展CYPlA酶活的个体差异研究对于临床个性化安全用药有着重要意义。目前国内外制药巨 头在药物开发过程中，需要在体外评估各候选新药抑制CYPlA的能力。因此，开发高效、灵 敏的特异性CYPlA探针底物对于高效筛选CYPlA抑制剂，及定量测定生物体系内CYPlA的 活性至关重要。
[0004] 由于CYPlA亚家族中的各亚型具有相似的氨基酸序列，其底物通常相互交叠，因 此各亚型酶鲜有特异性的底物。目前，已报道的CYPlA的巧光探针底物有3个，分别是3-氯 基-7-乙氧基香豆素，乙氧基试面灵和巧光素-ME-EGE。运些已知的巧光底物均属于Off-on 型探针，单酶选择性并不高且易受生物基质的干扰，定量误差较大。而比率型探针发射光谱 的蓝移/红移则可用于比率检测，且此时探针分子原型可作为内部校准来减小光照强度、 探针浓度、样品不均匀、仪器参数等对定量分析的影响。因此，开发高选择性的CYPlA比率 型巧光探针反应及其配套的高通量检测方法具有重要的实用价值。
【发明内容】
阳0化]
[0006] 本发明的目的在于提供一种细胞色素氧化酶CYPlA的比率型巧光探针底物及其 应用，该比率型巧光探针底物和去甲基化产物的巧光发射波长具有明显差异，且产物的巧 光量子产率更高更易检测。利用该探针反应可对多种生物体系中CYPlA的分布和功能进行 定量评价。
[0007] 本发明提供了一种细胞色素氧化酶CYPlA的比率型巧光探针底物，该探针底物可 被CYPlA特异性催化生成相应的0-去甲基化产物，该底物具有1，8-糞酷亚胺类结构，其结 构式如下：
[0008]
[0009] 其中，R为-C00H、苯甲酸、-SO3H中的任意一种，n为2~10。
[0010] 本发明还提供一种细胞色素氧化酶CYPlA的比率型巧光探针底物的应用，采用该 CYPlA亚酶的特异性底物，与含CYPlA的生物样品混合后进行酶促反应，通过定量检测单位 时间内的底物消除率或其去甲基化产物的生成率来定量测定不同生物体系中CYPlA的活 性，具体测定方法及条件如下：
[0011] A.体系中W1，8-糞酷亚胺类化合物作为比率型探针底物；底物浓度选择1/10~ IOKm;单点测定时底物浓度优选Km;
[0012] B.在PBS缓冲液中，反应溫度为20°C至60°C之间，优选37°C为最优反应时间；解 育体系抑介于5. 5~10. 5之间，优选抑7. 4为最优反应抑值； 阳01引 C.反应时间为5~120分钟，确保W上底物相应的0-去甲基化产物达到定量限且 底物转化率不超过20%时终止反应；
[0014] 化测定单位时间内底物减少量或0-去甲基化产物生成量作为CYPlA活性的评价 指标。
[0015] 所述的细胞色素氧化酶CYPlA的比率型巧光探针底物应用，其特征还在于所述的 生物体系为重组表达CYPlA单酶、人或动物组织制备液、各类哺乳动物组织细胞及其制备 物中的任意一种。
[0016] 该探针底物及其去甲基化产物的巧光信号需采用不同检测波长去检测，去甲基 化产物及底物的巧光检测条件分别为：激发波长450, 372nm，最大发射波长分别为564， 452nm〇
[0017] 该探针底物还可用于CYPlA抑制剂的快速筛选及抑制能力的定量评价。
[0018] 该探针底物也可作为实验动物在体及整体CYPlA的探针底物，评估代谢酶CYPlA 的个体及种属差异。
[0019] 本发明提供的细胞色素氧化酶CYPlA的比率型巧光探针反应的应用，该探针底物 及其0-去甲基化产物均具有巧光属性，且两者具有不同的光学属性，可采用巧光检测器同 时实现底物及产物的快速、灵敏检测；0-去甲基化产物及底物巧光检测条件分别为：激发 波长372,450nm，最大发射波长为450, 564nm如图3所示。
[0020] 该特异性探针底物为比率型巧光探针，其在CYPlA活性检测过程不易受生物体系 基质及杂质的干扰，可用于各种重组CYP1A、人及动物组织制备液及各类组织细胞中CYPlA 酶活的定量测定；同时也可作为在体及动物整体CYPlA的探针底物，评估代谢酶CYPlA的个 体及种属差异。该探针底物及0-去甲基化代谢产物的巧光检测方法还可用于CYPlA抑制 剂的快速筛选及抑制能力的定量评价。
[0021] 采用重组细胞色素氧化酶CYPlA单酶，肝微粒体解育体系进行考察，通过相关性 分析（如图5所示），重组单酶代谢反应（如图6所示），特异性抑制实验（如图7所示）， W及酶反应动力学几方面的证据，证明1，8-糞酷亚胺类化合物可特异性的经细胞色素氧 化酶CYPlA代谢（如图8所示），生成0-去甲基化氧化产物。进一步采用各种哺乳动物的 新鲜提取的肝细胞、原代培养肝细胞、肝切片、肝灌流等代谢评价体系进行考察，发现该 代谢反应具有非常良好的特异性。
[0022] 作为高特异性的细胞色素氧化酶CYPlA单酶的巧光探针底物，该化合物可W用来 检测CYPlA的活性，尤其适合用于对细菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞W及酵母菌克隆表达体 系生产的CYPlA的酶活测定，W及多种哺乳动物组织器官来源的微粒体、S-9等制备物中 CYPlA的活性标定。
[0023] 选用本发明所述细胞色素氧化酶CYPlA单酶的比率型巧光探针反应检细胞色素 氧化酶CYPlA单酶体外活性具有W下突出优势：
[0024] (1)高特异性：1，8-糞酷亚胺类化合物可被细胞色素氧化酶CYPlA单酶高特异性 地代谢成一个代谢产物，即0-去甲基化产物。
[00巧](2)廉价易得：1,8-糞酷亚胺类化合物可经化学合成获得，合成工艺简单易行，巧 光方法检测成本低。
[00%] (3)高灵敏度：具有1，8-糞酷亚胺母核结构的化合物均具有良好的巧光发射光谱 特性（450~700nm)，且该底物及其0-去甲基化代谢产物具有不同的巧光发射光谱特征，能 较好的进行区分检测，同时可通过比率型标准曲线的建立进行定量测定CYPlA单酶的检测 下限为0. 2nM/ml。
【附图说明】
[0027] 图1. 1，8-糞酷亚胺类化合物的结构通式； 阳02引 图2.N-(3-簇丙基）-4-甲氧基-1，8-糞酷亚胺的IH-NMR谱图；
[0029] 图3.N-(3-簇丙基）-4-甲氧基-1，8-糞酷亚胺及其0-去甲基化代谢产物的紫外 吸收光谱图（分别在372nm和450nm有最大吸收）； W30] 图4. 14例HLM对N- (3-簇丙基）-4-甲氧基-1，8-糞酷亚胺的代谢图；
[0031] 图5.N-(3-簇丙基）-4-甲氧基-1，8-糞酷亚胺及其0-去甲基化代谢速率与非那 西汀的0-脱乙基代谢速率的相关性分析实验；
[0032] 图6.N- (3-簇丙基）-4-甲氧基-1，8-糞酷亚胺的人CYP重组单酶筛选试验结果；
[003引图7.N-(3-簇丙基）-4-甲氧基-1，8-糞酷亚胺在人肝中的化学抑制实验结果；
[0034] 图8.CYPlA介导N- (3-簇丙基）-4-甲氧基-1，8-糞酷亚胺的代谢通路；
[0035] 图9.N-(3-簇丙基）-4-甲氧基-1，8-糞酷亚胺的合成路线。
【具体实施方式】
[0036] 下面的实施例将对本发明予W进一步的说明，但并不因此而限制本发明。
[0037] 本发明所采用的设备及其型号为：巧光发射/激发光谱是由Synergy化全功能微 孔板检测仪检测完成；Ih-NMR谱图是由核磁共振波谱仪（AvanceII400MHz)检测完成。 阳0測实施例1
[0039]N-(3-簇丙基）-4-甲氧基-1,8-糞酷亚胺的合成路线 柳4〇] (1)化合物1的合成
[0041] 将4. 2mmol4-氨基下酸加入到含有lg(3.61mmol)4-漠-1,8糞酢的50ml乙醇溶 液中，70-80°C反应过夜后，加入200ml水，析出大量固体，过滤，真空干燥得到米黄色固体 N- (3-簇丙基）-4-漠-1，8-糞酷亚胺，产率80-90 %。
[0042] 似化合物2的合成 阳0创将SOOmg化合物1与2. 54g碳酸钟置于100mL单口瓶中，加入30ml甲醇，60-70°C反应过夜后，冷却，用IM的盐酸将抑调至酸性，析出大量黄色固体，过滤，大量水洗，真空干 燥得到黄色固体N-(3-簇丙基）-4-甲氧基-1，8-糞酷亚胺，产率80-90%。 W44] 化合物1、2的结构如图9所示，N-(3-簇丙基）-4-甲氧基-1,8-糞酷亚胺及其 0-去甲基化代谢产物的紫外吸收光谱图如图3所示，分别在372nm和450nm有最大吸收； 制备的化合物2的核磁共振波谱分析图2所示，具体如下： 阳045]IhNMR(400MHz,DMSO) 5 = 1 2 . 0 5 (s, 1H) , 8 . 4 9 (ddd,J= 8. 4, 7. 8, 1. 1，2H)，8. 43 (d,J= 8. 3, 1H)，7. 80 (dd,J= 8. 3, 7. 4, 1H)，7. 31 (d,J= 8. 4, 1H)，4. 13 (S, 3H)，4. 06 (t,J= 7. 0, 2H)，2. 30 (t,J= 7. 4, 2H)，1. 88 (P,J= 7