一种dna双光子比率荧光粘度探针及其制备方法
【专利说明】-种DNA双光子比率巧光粘度探针及其制备方法 -、技术领域
[0001] 本发明设及一种DNA双光子比率巧光粘度探针及其制备方法，具体地说是一种具 有生物相容性、低毒性且着色于活体细胞细胞核DNA的双光子粘度探针及其制备方法。 二、【背景技术】
[0002] 细胞内的流体粘度与细胞内物质的运输、信号传导、生物大分子之间的作用W及 代谢产物的扩散等密切相关。比如，细胞质粘度的改变会影响到屯、肌细胞和肺巨隧细胞的 生物活性，而白细胞膜粘度的增加会加速衰老等。因此，在细胞水平上检测微环境的粘度是 一个重要的科学命题。目前虽然报道了许多巧光粘度探针，但能够实现活细胞成像的粘度 探针还比较少，特别是活细胞成像双光子巧光粘度探针鲜为报道。
[0003] 探针的巧光强度受到探针浓度的影响，单纯地通过巧光强度的改变检测细胞内的 微粘度的巧光探针只能给出细胞内高粘度区域的巧光图像，但不能给出细胞内巧光成像区 域的粘度值相对大小的梯度分布图像。然而采用比率巧光粘度探针可W消除探针浓度W及 仪器设备等因素引起的干扰，从而给出细胞内巧光成像区域的微粘度梯度分布图像。因此， 如何设计制备双光子比率巧光粘度探针，对于生命科学具有重要的意义。
[0004] 申请人对本申请的主题进行了如下的文献检索：
[000引 1、丽W.google,com网检索结果：（2015/08/18)
[000引 2、中国期刊网检索结果：
[0009] 检索方式一：
[0010] 篇名-双光子比率巧光粘度探针：无相关文献。
[0011] 篇名-DNA双光子比率巧光粘度探针：无相关文献。
[0012] 检索方式二：
[0013] 全文-双光子比率巧光粘度探针：无相关文献。
[0014] 全文-DNA双光子比率巧光粘度探针：无相关文献。 H、
【发明内容】
[0015] 本发明旨在提供一种DNA双光子比率巧光粘度探针及其制备方法，所要解决的技 术问题是通过分子设计合成具有双光子性能的D--A型的有机分子（目标分子TM),该 目标分子具有双吸收及双发射性能，对粘度具有明显的响应，可W作为粘度探针开发应用。 本发明目标分子在720nm左右具有较大双光子吸收截面，较强的双光子激发巧光和良好的 细胞亲和性，能够安全地用于活体细胞显微成像，着色于活体细胞细胞核DNA，给出细胞内 DNA的巧光成像区域的微粘度梯度分布图像，使之在生命科学研究领域具有广阔的应用前 景。
[0016] 本发明DNA双光子比率巧光粘度探针的结构式为：
[0017]
[001引本发明DM双光子比率巧光粘度探针的制备过程如下：
[0019] 1、中间体Ia的制备：
[0020] 在100血的圆底烧瓶中，依次加入0. 90g化mmol) 2-甲基苯并嚷挫及0. 85g化mmol) 舰甲烧，60-70°C下揽拌反应化；反应结束后冷却至室溫，抽滤且用乙酸多次洗涂，得白色 产物即为中间体la。
[0021] 2、中间体化的制备：
[002引在100血的圆底烧瓶中，依次加入0. 86g(4.Smmol) 5-漠嚷吩甲醒， 1. 13g(15mmol)2-(甲氨基）乙醇及0.Ig对甲苯横酸，100°C下揽拌反应20h;反应完全后加 入25mL蒸馈水，二氯甲烧萃取有机相，无水Mg2S04干燥过夜，抽滤，滤液减压浓缩，柱色谱分 离（展开剂按体积比石油酸：乙酸乙醋=2 : 1)，得到黄色固体即为中间体化。
[002引 3、目标分子TM的制备：
[0024] 100血圆底烧瓶中，加入0. 29g(l.Ommol)中间体la，0. 18g(l.Ommol)中间体化， 30mL绝对乙醇作溶剂，0.ImL赃晚作催化剂，80°C下回流揽拌反应地，得紫红色溶液；用 15血乙醇将0.25ga.0mmoリA评Fe溶解，随后加入所述紫红色溶液中，揽拌、加热至8(rC回 流反应30min，静置过滤，用乙醇洗涂2次，滤液冷却静置，得目标产物TM,为紫色晶状。。 [002引合成路线如下：
[0027] 与已有技术相比，本发明的有益效果体现在：
[0028] 1、本发明合成的目标分子是一类比率巧光粘度材料，具有双吸收及双发射性能， 对粘度具有明显的响应，同时，可W消除探针浓度W及仪器设备等因素引起的干扰，可W作 为比率巧光粘度探针开发应用（图1)。
[0029] 2、目标分子在长波处（720nm)具有较大的有效双光子吸收截面，同时具有激发能 量低、穿透性强、光损伤小、低毒等特点，其有效双光子吸收截面随着溶液粘度的增大而明 显增大，具有作为双光子巧光粘度探针的应用价值（图2)。
[0030] 3、目标分子具有很好的生物相容性和细胞通透性，双光子显微成像实验表明，该 化合物能够穿过细胞膜，进入细胞，均匀着色细胞核DNA(图3)，从显影结果可W清晰的看 到处于不同时期的细胞。不存在类似可利用的商业生物巧光粘度探针，具有较强的商业价 值。
[0031] 4、利用目标分子的比率巧光粘度探针的性能，结合双光子巧光显微成像，能够给 出细胞内巧光成像区域的微粘度梯度分布图像（图4)，使之在生命科学研究领域具有广阔 的应用前景。
[0032] 5、本发明合成的目标分子TM,原料易得，反应条件溫和，合成步骤简单，使其商业 化成为可能。 四、
【附图说明】
[0033]图1是目标化合物TM在不同粘度溶液中的巧光变化，TM的短波发射及长波发射 巧光随着溶液粘度的增大均有明显的增强。其中A)TM在不同粘度溶液中的巧光变化 =335nm) ;B)水 / 甘油混合溶液中 log(1(3。5。"/138。?)和 Iog(Viscosity)的线性关系（入。X=335nm) ;C)TM红色巧光在不同粘度溶液中的变化（A。、= 560nm) ;D)水/甘油混合溶 液中l〇g(I/I。）和Iog(Viscosity)的线性关系（Am= 560nm)。在短波（335nm)及长波 巧60nm)激发下，其发射光强度值的对数均与溶剂粘度值的对数成很好的线性关系，满足 巧i-slcr. -Hoffmann方程对染料作为比率粘度探针检测微环镜粘度变化的要求。说明TM具 有作为比率巧光粘度探针W检测微环境粘度变化的开发应用潜力。
[0034] 图2是目标化合物TM在不同粘度溶剂中的有效双光子吸收截面。说明粘度对该 探针的双光子效应具有显著的影响，并且TM具有较大的有效双光子吸收截面，具有作为双 光子粘度探针的开发价值。
[0035] 图3是目标化合物TM与肝癌细胞的单光子及双光子共聚焦成像。其中A)单光子 作用图曲双光子作用图；C)叠加图；D)不同时期的细胞成像图。说明该探针具有细胞通 透性和细胞摄取性，着色于细胞核DNA。并且可W通过DNA显影结果，观察处于不同时期的 细胞。
[0036] 图4是目标化合物TM着色的人体肝癌细胞的双光子激发巧光显微照片。其中A) 绿色通道成像图；B)红色通道成像图；C)细胞内巧光成像区域的微粘度梯度分布图像。说 明利用双光子激发巧光显影，通过短波及长波通道的巧光强度比值，给出细胞内巧光成像 区域的微粘度梯度分布图像，使之在生命科学研究领域具有广阔的应用前景。 五、
【具体实施方式】
[0037] 本实施例中DNA双光子比率巧光粘度探针的制备过程如下：
[0038] 1、中间体Ia的制备：
[0039] 在100血的圆底烧瓶中，依次加入0. 90g化mmol) 2-甲基苯并嚷挫及0. 85g化mmol) 舰甲烧，60-70°C下揽拌反应化；反应结束后冷却至室溫，抽滤且用乙酸多次洗涂，得白色 产物1. 6g，即为中间体la。
[0040]'HNMR: (400Hz,dg-DMSO), 5 (ppm) : 8. 43 (d,J= 8.IHz,IH), 8. 29 (d,J= 8. 5Hz,IH)，7. 90 (t,J= 7. 9Hz,IH)，7. 81 (t,J= 7. 7Hz,IH)，4. 20 (s, 3H)，3. 16 (s, 3H).
[0041]2、中间体化的制备：
[004引在100血的圆底烧瓶中，依次加入0. 86g(4. 5mmol)5-漠嚷吩甲醒， I. 13g(15mmol)2-(甲氨基）乙醇及0.Ig对甲苯横酸，100°C下揽拌反应20h;反应完全后加 入25mL蒸馈水，二氯甲烧萃取有机相，无水Mg2S04干燥过夜，抽滤，滤液减压浓缩，柱色谱分 离（展开剂按体积比石油酸：乙酸乙醋=2 : 1)，得到黄色固体0. 29g，即为中间体化。
[0043]电NMR: (400Hz,de-DMSO)，5 (ppm) : 9. 40(S,1H)，7. 65 化J= 4. 4Hz, 1H)，6. 12 化J =4.4Hz, 1H), 4.87 (t,J= 5.4Hz, 1H), 3.62 (q,J= 5.5Hz, 2H), 3.47 (t,J= 5. 6Hz, 2H)，3. 09 (s, 3H).
[0044] 3、目标分子TM的制备：
[0045] 100血圆底烧瓶中，加入0. 29g(l.Ommol)中间体la，0. 18g(l.Ommol)中间体化， 30mL绝对乙醇作溶剂，0.ImL赃晚作催化剂，80°C下回流揽拌反应地，得紫红色溶液；另取 25血小烧杯，用15血乙醇将0. 25g(l.Ommol)A评Fe溶解，然后将此溶液加入前述的紫红色 溶液中，揽拌、加热至80°C回流反应30min，静置过滤，用乙醇洗涂2次，滤液冷却静置，得紫 色晶状TM0.40邑。
[0046] Ih NMR(400MHz, de-DMSO) 5 8. 08 (t, J = 12. IHz, 1H)，7. 84 (d, J = 8. 3Hz，lH)，7. 64(t，J = 7. 9Hz，lH)，7. 50(t，J = 7. 7Hz，lH)，6. 56(s，lH)，5. 01(t，J = 5. 2Hz, IH), 3. 97(s, IH), 3. 80 - 3. 59(m, 2H), 3. 28(s, IH). "c NMRdOOMHz，de-DMSO) 5 179 .7, 171. 5, 167. 9, 161. 2, 142. 6, 141. 9, 128. 9, 126. 2, 125. 4, 123. 7, 114.：M，109. 9, 98. 5, 5 8. 5,42. 1，34. 6. FT-IR(邸r, cmI):3235(S)，2920(W)，1642(W)，1590(S)，1520 (m), 1474(W) ,1435(w), 1372(m), 1329(m), 1162(s), 1039(m), 943(w), 881 (w), 811 (w),612 (w),548 (w). M"(MS/ESI), 331. 25.
【主权项】
1. 一种DNA双光子比率荧光粘度探针，其特征在于其结构式为：2. -种权利要求1所述的DNA双光子比率荧光粘度探针的制备方法，其特征在于包括 如下步骤： 1) 中间体la的制备 向反应器中依次加入6mmol2-甲基苯并噻唑及6mmol碘甲烷，60-70°C下搅拌反应3h; 反应结束后冷却至室温，抽滤且用乙醚洗涤，得白色产物即为中间体la; 2) 中间体lb的制备 向反应器中依次加入0. 86g5-溴噻吩甲醛，1. 13g2-(甲氨基）乙醇及0.lg对甲苯磺 酸，100°C下搅拌反应20h;反应完全后加入25mL蒸馏水，二氯甲烷萃取有机相，无水Mg2S04 干燥，抽滤，滤液减压浓缩，柱色谱分离后得到黄色固体即为中间体lb; 3) 目标分子TM的制备 向反应器中加入0. 29g中间体la，0. 18g中间体lb，30mL绝对乙醇作溶剂，0.lmL哌啶 作催化剂，80°C下回流搅拌反应4h，得紫红色溶液；用15mL乙醇将0. 25gAgPF6溶解，随后 加入所述紫红色溶液中，搅拌、加热至80°C回流反应30min，静置过滤，用乙醇洗涤，滤液冷 却静置，得目标产物TM，为紫色晶状。。
【专利摘要】本发明公开了一种DNA双光子比率荧光粘度探针及其制备方法，其中DNA双光子比率荧光粘度探针的结构式为：本发明合成的目标分子是一类比率荧光粘度材料，具有双吸收及双发射性能，对粘度具有明显的响应，同时，可以消除探针浓度以及仪器设备等因素引起的干扰，可以作为比率荧光粘度探针开发应用。
【IPC分类】C07D417/06, A61K49/00, C09K11/06
【公开号】CN105295897
【申请号】CN201510582912
【发明人】田肖和, 李丹丹, 吴杰颖, 周虹屏, 李胜利, 李飞, 郁建华, 田玉鹏
【申请人】安徽大学
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2015年9月14日