的探针方法
【技术领域】
[0001] 本发明属分析化学领域，具体地说是一种用比率荧光、比率吸收和目视检测微量 F_的探针方法。
【背景技术】
[0002] 荧光探针能高灵敏、高选择检测特定离子，特别适用于生物和特殊样品的测定，是 荧光探针应用的主要方法。具备比率荧光、比率吸收性能的探针是利用不同波长荧光发射 或吸收的比率变化进行测定，有更高的检测灵敏度和准确度。用比率荧光、比率吸收方式检 测有别于单一波长范围的荧光或吸收强度的变化检测，在实际应用中受到探针自身浓度、 测试条件、光源强度波动及仪器敏感性等因素的影响小，通过两个不同波长下荧光的比值 变化，能够将影响测定准确性的因素降低，使检测的响应线性范围、检测限特别是准确性等 显著提高。目前，利用比率荧光或比率吸收进行离子测定的探针试剂的报道相对较少。
[0003] 氟是电负性最大的元素，化学性质活泼。作为重要的阴离子，氟离子广泛存在于环 境和生命活动过程中。实现对氟离子简便、快速、准确的检测在临床医学及食品、环境分析 中尤为重要。开发结构简单、价格低廉、灵敏度和选择性优越的氟离子荧光试剂在很多相关 领域具有应用价值。大多数的氟离子荧光探针为单一波长检查，且受共存离子干扰。同时具 备比率荧光和比率吸收检测性能的为数极少，而又具备裸眼识别检测则更具优势。
[0004] 本发明利用一种简单结构的喹哪啶衍生物作为检测微量氟离子荧光探针，利用探 针与氟离子形成比率荧光和比率吸收的光谱特性，控制探针与测定离子的浓度比，即可用 荧光及紫外-可见吸收光谱进行检测。同时，还可利用探针与氟离子识别时强烈的颜色变 化，分别在紫外灯下和可见光下实现氟离子的快速、定性、半定量检测。方法简便、准确、可 视性好，检测速度快，可操作性强。
【发明内容】
[0005] 本发明目的在于建立了一种新的高灵敏、高选择、定量检测微量氟离子的荧光和 紫外-可见吸收光谱方法;半定量、定性检测微量氟离子的目视检测探针方法。
[0006] 本发明一种比率荧光、比率吸收或目视检测微量F的探针方法是用化学名为(E)-2-(2,4_二乙酰氧基苯基）乙烯基-8-乙酰氧基喹啉的化合物作为检测Γ的荧光或比色探针 试剂，简称探针，其结构如下：
检测方法为：（1)荧光光谱法测定时，探针在乙腈溶液中，以350nm为激发波长，F离子 使探针在415nm处的荧光峰降低，在560nm处出现新荧光峰，形成比率荧光，在475nm处有等 发射点，560nm与415nm处的比率荧光强度随F离子浓度而变化；（2)紫外-可见吸收光谱法 测定时，探针在乙腈溶液中，F离子使探针在280nm和340nm处的紫外吸收峰降低，在455nm 处出现新的吸收峰，在360nm处有等吸收点，455nm与340nm处形成比率吸收，比率吸收强度 随F离子浓度而变化；（3)目视检测F离子时颜色变化明显：日光下探针溶液颜色随F浓度 的增加，由无色逐渐变为黄色至橙红色;在365nm紫外灯下溶液荧光颜色随Γ离子的浓度增 加，由蓝色逐渐变为黄色至橙红色；用浸有探针的滤纸条作测试纸，测定不同浓度的F离 子，滤纸条颜色随F离子的浓度增加，在日光下的颜色由无色逐渐变为黄色至橙红色；在 365nm紫外灯下滤纸条的荧光颜色由蓝色逐渐变为黄色至橙红色。
[0007] 所述的一种比率荧光、比率吸收或目视检测微量F的探针方法是在乙腈介质中， 荧光法检测Γ离子时，应控探针：Γ离子的摩尔浓度大于或等于1:2;紫外-可见吸收法检测 Γ离子时，应控制探针：Γ离子摩尔浓度大于或等于1:4。
[0008] 所述的一种比率荧光、比率吸收或目视检测微量F的探针方法是（1)探针荧光法 检测F-时，其它共存阴离子包括Cl-，Br-，Γ，AcO-，HS〇4-，N〇3-，Cl〇4-，H2P〇4-，PF6-之一，在浓度 与F相同时，对F的测定无干扰；（2)探针紫外-可见吸收光谱法检测F时，其它共存阴离子 Cl-，Br-，Γ，AcO-，HS〇4-，N〇3-，Cl〇4-，H2P〇4-，PF6-之一，在浓度与F-相同时，对F-的测定无干扰。
[0009] 所述的一种比率荧光、比率吸收或目视检测微量F的探针方法的应用是（1)探针 用光谱法定量检测微量F离子:荧光法检测Γ的浓度线性范围为20~200μΜ，检测限为1.6μΜ; 紫外-可见吸收法检测Γ的浓度线性范围为40~400μΜ，检测限为16.5μΜ; (2)探针用目视法 定性、半定量检测微量F离子:用探针在溶液中或用浸有探针的滤纸检查Γ离子浓度的检测 范围均为50μΜ~10mM，检测限均低至50μΜ。
[0010] 本发明方法的关键技术是控制探针与待测离子的浓度比。所用探针化合物结构简 单，合成容易，成本低廉。检测方法不仅可用荧光光谱、紫外-可见吸收光谱中的比率荧光和 比率吸收定量检测微量F离子，同时，还可利用探针用目视法定性、半定量，在溶液中或用 试纸检测微量Γ离子。本发明有别于其他如离子色谱、离子选择性电极等氟离子检测方法， 具有灵敏、准确、简便、快速。可适用于特殊样品如生物、及其微量的样品检测。
[0011]
【附图说明】
[0012]图1探针与阴离子的荧光光谱。
[0013] 在浓度为1〇μΜ的探针的乙腈溶液中，分别加入ΙΟμΜ阴离子F-，Cl-，Br-，I-，AcO-，HS〇4'N〇3_，Cl〇4'H2P〇4'PF6_时，没有观察到荧光光谱明显的变化;而加入20μΜ上述阴离子 时，只有F+的加入使探针在415nm处的荧光峰降低，同时，在560nm处出现新荧光峰，形成比 率荧光。表明在此条件下探针仅对Γ有识别检测作用。激发波长为350nm。
[0014]图2探针与阴离子的紫外-可见吸收光谱。
[0015] 在浓度为1〇μΜ的探针的乙腈溶液中，分别加入30μΜF，40yM的阴离子Cl'Br一，Γ，AcO-，HS〇4-，N〇3-，Cl〇4-，H2P〇4-，PF6-时，没有观察到紫外-可见吸收光谱明显的变化;而40 μΜF的加入使探针在280nm和340nm处的吸收峰降低，同时，在455nm处出现新的吸收峰，形 成比率吸收。表明在此条件下探针仅对Γ有识别检测作用。
[0016]图3不同浓度的F对探针的荧光光谱滴定图。
[0017] 在浓度为1〇μΜ的探针的乙腈溶液中，分另lj加入不同浓度Γ到探针溶液中，随F的加 入，测得荧光光谱滴定曲线。探针在475nm处出现一个等发射点，560nm与415nm波长处的荧 光强度形成比率荧光，随?Π农度而变化。测试的激发波长为350nm。
[0018] 图4不同浓度F对探针的紫外-可见吸收光谱滴定图。
[0019] 在浓度为ΙΟμΜ的探针的乙腈溶液中，分别加入不同浓度Γ到探针溶液中，随F的加 入，测得紫外-可见吸收光谱滴定曲线。探针在352nm处出现一个等吸收点，455nm与340nm波 长处吸光度形成比率吸收，随?Π农度而变化。
[0020] 图5共存阴离子对探针荧光法检测F的影响。
[0021] 在浓度为ΙΟμΜ的探针的乙腈溶液中，加入0.2mM的F-后探针在415nm处的荧光峰 降低，同时，在560nm处出现新焚光峰。测定560nm与415nm处形成的比率焚光强度;再分别 向探针-F-混合溶液中加入0·2mM的其他阴离子Cl-，Br-，Γ，AcO-，HS〇4-，N〇3-，Cl〇4-，H2P〇4-， PFfT后测其比率荧光强度变化。黑色条表示在探针中加入不同阴离子后在波长560nm和 415nm处的比率荧光强度。白色条表示在探针混合溶液再分别加入上述其他共存阴离子 后在波长560nm和415nm处的比率荧光强度变化。表明探针检测F的比率荧光强度不受上述 其他阴离子共存的影响。测试的激发波长为350nm，比率荧光波长为560nm与415nm。纵坐标 为波长分别为560nm与415nm处荧光强度的比值。
[0022] 图6共存阴离子对探针紫外-可见吸收法检测F的影响。
[0023] 在浓度为ΙΟμΜ的探针的乙腈溶液中，加入0.4mM的F-后，探针在280nm和340nm处 的吸收峰降低，同时在455nm处出现新的吸收峰。测定455nm与340nm处形成的比率吸收;再 分别向其混合溶液中加入〇 . 4mM的其他阴离子Cl-，Br-，Γ，AcO-，HS〇4-，N〇3-，Cl〇4-，H2P〇4-， PFf后测其比率吸光度变化。黑色条表示在探针中加入不同阴离子后在波长455nm与340nm 处比率吸收值。白色条表示在探针-F溶液再分别加入上述其他共存阴离子后在波长455nm 与340nm处的比率吸收值变化。表明探针检测F的比率吸收不受上述其他试阴离子共存的 影响。比率吸收波长为455nm与340nm。纵坐标为吸收波长分别为455nm与340nm处吸光度的 比值。
[0024]图7探针检测?_的荧光光谱法校正曲线。
[0025]在浓度为1ΟμΜ的探针的乙腈溶液中分别加入不同浓度F，测定比率荧光值。纵坐 标为波长分别为560nm与415nm处荧光强度的比值，横坐标为Γ的浓度。?Π农度在20~200μΜ范 围内与探针的比率荧光强度成线性关系。激发波长为350nm。
[0026]图8探针检测F的紫外-可见吸收光谱法校正曲线。
[0027]在浓度为1ΟμΜ的探针的乙腈溶液中分别加入不同浓度F，测定比率吸收值。纵坐 标为吸收波长分别为455nm与340nm处吸光度的比值，横坐标为Γ的浓度。?Π农度在40~400μ Μ范围内与探针的比率吸光度成线性关系。
[0028] 图9浓度为10mM探针检测不同浓度F的溶液颜色变化。
[0029] 上图为可见光下观察，在F的浓度50μΜ~10mM范围内，随?Π农度增加，探针检测F溶 液颜色由无色变为黄色逐渐变为橙红色。下图为365nm紫外灯下观察，在F的浓度50μΜ~ 10mM范围内，随?Π农度增加，探针检测Γ溶液荧光颜色由蓝色逐渐变为黄色至橙红色。
[0030] 其中各数字代表1:探针+0μΜF-;2:探针+50μΜF-;3:探针+(KlmMF-;4:探针+ 0.5mMF-;5:探针+lmMF-;6:探针+10mMF-。
[0031]图10滤纸条测试探针检测不同浓度F的染色变化。
[0032] 上图为可见光下观察，浸有浓度为0.ImM的探针的滤纸条检测浓度在50μΜ~10mM范 围内的Γ颜色变化，随农度增加，滤纸颜色由无色逐渐变为黄色至橙红色。
[0033]下图为365nm紫外灯下观察，浸有浓度为O.lmM的探针的滤纸条检测浓度在50μΜ~ 10mM范围内的Γ颜色变化，随?Π农度增加，滤纸的荧光由蓝色逐渐变为黄色至橙红色。
[0034] 其中各数字代表1:探针+0μΜF-;2:探针+50μΜF-;3:探针+(KlmMF-;4:探针+ 0.5mMF-;5:探针+lmMF-;6:探针+10mMF-。