以荧光碳点为探针运用倍频散射法检测胰蛋白酶的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种胰蛋白酶浓度的检测方法。更具体地说，本发明涉及一种利用荧光碳点倍频散射光检测胰蛋白酶的方法。
【背景技术】
[0002]胰蛋白酶为蛋白酶的一种，作为消化酶而起作用。在胰脏是作为酶的前体胰蛋白酶原而被合成的。作为胰液的成分而分泌，受肠激酶，或胰蛋白酶的限制分解成为活化胰蛋白酶，是肽链内切酶，它能把多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基侧切断。它不仅起到消化酶的作用，而且还能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前体，起活化作用。是特异性最强的蛋白酶，在决定蛋白质的氨基酸排列中，它成为不可缺少的工具。
[0003]近年来，荧光碳点是继富勒烯、碳纳米管及石墨烯之后最热门的碳纳米材料之一。这种纳米材料克服了传统量子点的某些缺点，不仅具有优良的光学性能与小尺寸特性，而且具有良好的生物相容性，易于实现表面功能化，在生化传感、成像分析、环境检测、光催化技术及药物载体等领域具有很好的应用潜力。但迄今为止，将荧光碳点荧光探针用于胰蛋白酶检测的相关报道仍未见。
[0004]光散射现象广泛存在于光与粒子的作用过程中，是指当光通过介质时在入射光方向以外的各个方向上所观察到的光现象。它源于光电磁波的电场振动而导致的分子中电子产生的受迫振动所形成的偶极振子。根据电磁理论，振动着的偶极振子是一个二次波源，它向各个方向发射的电磁波就是散射波。光散射与介质的不均匀性有关，除了真空之外的其它所有介质都有一定程度的不均匀性，从而产生散射光。如今，光散射技术逐步发展成为一门新的分析技术。该技术具有简便、快速，灵敏度高，仪器操作方便等优点。近年来已被成功应用于核酸、蛋白质、无机离子、免疫和药物等的分析测定。但迄今为止，将荧光碳点作为探针，利用胰蛋白酶增强荧光碳点倍频散射光强度的特性，用于检测胰蛋白酶的相关报道仍未见。
【发明内容】
[0005]本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。
[0006]本发明还有一个目的是提供一种荧光碳点检测胰蛋白酶的新方法，该方法操作简单，检测快速且灵敏度高，能进行溶液中胰蛋白酶的高灵敏识别，且检出限低。
[0007]本发明还有一个目的是研究荧光碳点在胰蛋白酶浓度检测中的新应用。
[0008]为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种以荧光碳点为探针运用倍频散射法检测胰蛋白酶的方法，包括:
[0009]在激发波长为690nm的条件下，对荧光碳点与胰蛋白酶的结合物进行激发，以产生倍频散射光，检测倍频散射光的强度选择最优的激发波长，将所述倍频散射光的强度与相同检测条件下建立的胰蛋白酶浓度的标准曲线进行比对，以获得胰蛋白酶浓度。
[0010]优选的是，其中，胰蛋白酶浓度的标准曲线的建立方法具体为:
[0011]配制含荧光碳点的不同浓度的胰蛋白酶标准溶液，在激发波长为690nm的条件下，检测标准溶液的倍频散射光强度，建立标准溶液的倍频散射光强度与胰蛋白酶浓度之间的线性关系，获得胰蛋白酶浓度的标准曲线，用于检测样品溶液中胰蛋白酶浓度。
[0012]优选的是，其中，含荧光碳点的不同浓度的胰蛋白酶标准溶液的配制方法具体为:
[0013]取不同体积的胰蛋白酶原溶液，并向其中分别添加相同体积的荧光碳点及不同体积的缓冲溶液至混合液的体积相等，得到等体积含荧光碳点的不同浓度的胰蛋白酶标准溶液。
[0014]优选的是，其中，配制所述样品溶液的方法为:
[0015]向未知胰蛋白酶溶液中加入一定体积的荧光碳点，使得与所述标准溶液中荧光碳点的体积相同，加入缓冲溶液至与所述标准溶液的体积相同，得到所述样品溶液。
[0016]优选的是，其中，所述缓冲溶液为pH为6的磷酸盐缓冲溶液。
[0017]优选的是，其中，所述标准溶液和所述样品溶液中荧光碳点的浓度均为6.lmg/mL。
[0018]优选的是，其中，所述标准溶液与所述样品溶液的体积均为3mL。
[0019]优选的是，其中，所述胰蛋白酶原液的浓度为3X104mol/L、3X105mol/L、3X10 6mol/L 或 3X 10 7mol/L。
[0020]优选的是，其中，所述荧光碳点的制备方法为:
[0021]步骤a、将1.0g分子量为1500的聚乙二醇和15ml甘油搅拌后置于微波反应器中，在140°C下高温反应15min ；
[0022]步骤b、将步骤a得到的样品冷却到50°C后加入1.0g的丝氨酸，然后升温至180°C微波反应lOmin ；
[0023]步骤c、将步骤b得到的样品注入分子量1000的透析袋中透析24小时后进行蒸发浓缩，得到300ml的透析液；
[0024]步骤d、将所述300ml的透析液在60°C下旋转蒸发一个小时，得到260ml样品，所述样品即为荧光碳点。
[0025]本发明至少包括以下有益效果:
[0026]1、本发明将荧光碳点作为探针，利用荧光碳点的倍频散射光强度随胰蛋白酶溶液的浓度的增加而增强的特性，对胰蛋白酶的浓度进行高灵敏检测，该方法操作简单、检测快速、灵敏度高且选择性好，可对混合样品中胰蛋白酶进行在线原位快速灵敏检测，检出限可达到 7.8X10 10mol/Lo
[0027]2、本发明通过微波反应合成法制备的荧光碳点的细胞毒性低，反应条件温和可控，且产率较高，且能够与胰蛋白酶有效地进行特异性结合，生成一种结合物，该结合物能够在一定波长的光的激发下进行跃迀，而产生倍频散射光，通过检测倍频散射光的强度，进而得到胰蛋白酶的浓度。
[0028]本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
【附图说明】
[0029]图1为本发明的一个实施例中标准溶液的倍频散射光谱图；
[0030]图2为本发明的一个实施例中胰蛋白酶浓度的标准曲线。
【具体实施方式】
[0031]下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
[0032]<实施例1>
[0033]一、焚光碳点的合成
[0034]将l.0g分子量为1500的聚乙二醇和15ml甘油搅拌后置于微波反应器中，在140°C下高温反应15min，待试管冷却到50°C后加入1.0g的丝氨酸，然后升温至180°C微波反应lOmin，将制得的样品注入分子量1000的透析袋中透析24小时后进行蒸发浓缩，得到300ml的透析液，将所述300ml的透析液在60°C下旋转蒸发一个小时，得到260ml样品，所述样品即为荧光碳点。
[0035]二、建立胰蛋白酶浓度的标准曲线
[0036]1、配制含荧光碳点的不同浓度的胰蛋白酶标准溶液，具体为:
[0037]取不同体积的浓度为3X10 4mol/L的胰蛋白酶原溶液，并向其中分别添加相同体积的荧光碳点及不同体积的pH为6的磷酸盐缓冲溶液至混合液的体积均为3mL，其中，荧光碳点的浓度为6.lmg/mL，得到等体积含荧光碳点的不同浓度的胰蛋白酶标准溶液，该标准溶液中胰蛋白酶的浓度分别为 0,1X10 9mol/L、7X 10 9mol/L、3X 10 smol/L、5X 10 smol/L、7X 10 smol/L、1 X 10 7mol/L，依次标记为 g、f、e、d、c、b、和 a。
[0038]2、检测标准溶液的倍频散射光强度并建立标准曲线，具体为:
[0039]将上述标准溶液静置3分钟后，在激发波长690nm的条件下，对标准溶液进行激发，从而产生倍频散射光，检测标准溶液的倍频散射光强度，图1为标准曲线的倍频散射光谱图，从倍频散射光谱图可得知荧光碳点的倍频散射光信号强度随胰