表达aa9家族多糖单加氧酶基因tlaa9?2的毕赤酵母工程菌株的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种表达AA9家族多糖单加氧酶基因TLAA9?2的毕赤酵母工程菌株，是通过RT?PCR方法从疏绵状嗜热丝孢菌Thermomyces lanuginosus获得糖苷水解酶基因TLAA9?2，将其克隆并插入到毕赤酵母整合表达载体pPICZαA中，然后将得到的糖苷水解酶基因TLAA9?2表达载体pPICZαA/TLAA9?2导入到毕赤酵母GS115中，再从中筛选出一种表达糖苷水解酶基因TLAA9?2的酵母工程菌GS?CT?9?1。该工程菌表达的糖苷水解酶TLAA9?2对内切纤维素酶的活性具有明显的促进作用，混合酶比原始内切酶N24的降解纤维素的活性提高1.2倍。CGMCC No.1238420160421
【专利说明】表达AA9家族多糖单加氧酶基因 TLAA9-2的毕赤酵母工程菌株 (-)技术领域
[0001]本发明设及生物工程，具体地说是一种表达是疏绵状嗜热丝抱菌化ermomyces lanuginosusAA9家族多糖单加氧酶基因化449-2的毕赤酵母工程菌株Pichia pastoris GS-CT-9-2。 (二)【背景技术】
[0002] 多糖单加氧酶（英语：Polysaccha;ride monooxygenases)，又称多糖单氧酶）是一 种专口氧化裂解糖巧键，并产生多个纤维寡糖分子的酵素，也是自然界中的常见酵素之一。 运类蛋白质在人类的产业上也有所应用，例如用来将纤维素与半纤维素等生物质能降解成 可用的小分子。多糖单加氧酶具有多个家族。疏绵状嗜热丝抱菌化ermomyces lanuginosus 是一种广泛分布于堆肥中的嗜热真菌。该菌在微晶纤维素为唯一碳源的培养基中50°C条件 下可W产生热稳定的纤维素酶和AA9家族多糖单加氧酶。
[0003] 疏绵状嗜热丝抱菌产生的AA9家族多糖单加氧酶TLAA9-2具有氧化裂解纤维素的 作用，并且对该菌株产生的内切纤维素酶N24的酶活性具有明显的促进作用，可使其活性提 高1.2倍。多糖单加氧酶发挥其活性需要供电子体（抗坏血酸或CDH)的存在，经薄层层析 (化C)检测产生多种纤维寡糖。该酶在缺乏底物的情况下可W产生过氧化氨，并且经飞行质 谱鉴定该酶氧化裂解打断纤维素长链主要产物为纤维寡糖。 (H)
【发明内容】
[0004] 本发明从疏绵状嗜热丝抱菌化ermomyces lanuginosus获得多糖单加氧酶cDNA序 列全长，命名为TLAA9-2，TLAA9-2基因 DNA全长82化P，包括信号肤序列，起始密码子和终止 密码子，无内含子，编码252个氨基酸。具有信号肤序列（l-22aaMKGSTTA化化化LASVTRTSA) 及30个0糖基化位点，有一个潜在的N糖基化位点。将TLAA9-2编码的氨基酸序列在国际基因 库中进行检索，发现属于多糖单加氧酶第AA9家族。
[000引构建重组表达质粒载体pPICZaA/TLAA9-2，利用电转仪进行电击转化 Pichiapastoris GS115,在Zeocin培养基上筛选，经PCR鉴定筛选阳性转化子，高浓度博来 霉素筛选多拷贝转化子，然后进行甲醇诱导表达，获得毕赤酵母工程菌株GS-CT-9-2。该工 程菌株接种于含BMGY培养基中，在28°C20化pm/min摇床培养6d后，多糖单加氧酶的表达量 为3.21mg/ml，分子量为45kDa，TLAA9-2最适溫度为50-55°C，在60 °C下是稳定的，处理60min 后仍有90%W上的酶活性；70°C处理30min后仍保持68%的活性；80°C处理30min后保持 23 %的活性;90°C处理30min活性几乎完全丧失。
[0006] AA9家族多糖单加氧酶TLAA9-2在供电子体(抗坏血酸和CDH)和铜离子存在下能将 纤维素长链氧化裂解为不同的纤维寡糖，并且在缺乏底物的情况下可W产生过氧化氨，对 内切纤维素酶N24的酶活性具有明显的促进作用，混合酶比原始酶N24的降解纤维素的能力 提高1.2倍。多糖单加氧酶第一个组氨酸具有重要作用，前端连有其他氨基酸会影响其活 性。不同的多糖单加氧酶氧化裂解纤维素长链发生在不同的连键位置，经飞行质谱鉴定 TLAA9-2氧化裂解纤维素长链主要产物为纤维寡糖。 (四）
【附图说明】：
[0007] 图1 AA9家族多糖单加氧酶TLAA9-2的SDS-PAGE分析 [000引泳道1:低分子量蛋白标准
[0009] 泳道2:纯化的AA9家族多糖单加氧酶TLAA9-2
[0010] 图2 AA9家族多糖单加氧酶TLAA9-2的最适溫度
[0011] 图3 AA9家族多糖单加氧酶TLAA9-2对内切纤维素酶N24活性的促进作用
[0012] 图4 AA9家族多糖单加氧酶TLAA9-1氧化裂解纤维素薄层层析检测及供电子体(抗 坏血酸)对AA9家族多糖单加氧酶TLAA9-1活性的影响
[0013] 泳道1:标准纤维寡糖分子(M)
[0014] 泳道2:未加抗坏血酸的多糖单加氧酶TLAA9-UE)
[0015] 泳道3:添加抗坏血酸的多糖单加氧酶TLAA9-1化+Vc)
[0016] 图5 AA9家族多糖单加氧酶TLAA9-1酶解产物飞行质谱分析 (五)
【具体实施方式】
[0017] 实施例1:疏绵状嗜热丝抱菌化ermomyces lanuginosusermophil皿的分离鉴定
[0018] (1)标本采集:从堆肥中采集。
[0019] (2)分离培养:将采集标本取0.5克放置在PDA平板上5(TC培养3天后，进行分离纯 化。操作步骤参考Cooney and血erson( 1964)文献。
[0020] (3)鉴定：参考Coon巧 and 血erson(1964)和LaTouche(1950)文献。
[0021 ] 实施例2:多糖单加氧酶基因 TLAA9-2的克隆
[0022] (1)疏绵状嗜热丝抱菌I'hermomyces lanuginosusermo地ilum总RNA的提取：参照 Trizol试剂盒说明。
[0023] (2)cDNA第一条链的合成：按照hkara公司的IMaRa RNA PCR kit(AMV)Ver3.0试 剂盒说明书进行：取1~化g总RNA，加脚ase Free d加 2〇至9 .扣L，将RNA样品在75 °C变性 5min，立即在冰浴中冷却5min，然后稍微离屯、一下，在冰浴中依次加入W下各种成分： lOmmol/L dNTP MixUire 2化，10XRT Buffer(Mg2+)化L，25mmol/L MgCb化L，01igo d(T)- Adaptor Primer luL^RNase Inhibiter 0.5jiL，AMV Reverse Transcriptase ljiL(Final Volume 20化），将反应液混合后，室溫下放lOmin，然后42°C溫育60min，再煮沸5minW灭活 反转录酶。加入18化L DEPC处理的dd出0,稀释至20化L，混匀，稍微离屯、，保存于-20°C，备 用。
[0024] (3)PCR反应（2 化L):cDNA化L，10XBuffer 2.扣L，10mmol/L dNTP 化L，25mmol/ LMgCl2化L，上、下游引物各化L，hq DNA聚合酶0.扣L(抓/化），d地20 1化L。反应条件为94 1：5111111预变性;941：4〇3,561：4〇3,72°(：1111111，共32个循环，72°(：延伸1〇111111，4°(：保存。
[00 巧]上游引物：5 ' -AGGGGTATCTCTCGAGAAAAGACACGGGTTTGTCTCCAACCT-3 '
[00%]下游引物：5 ' -GAGTTTTTGTTCTAGACCCGCCGCCGCCGGCGTCG-3 '
[0027] (4)基因克隆：取0.扣1 PCR产物与PMD18-T载体进行连接，操作步骤按照TAKARA公 司产品说明书进行。然后连接产物转化大肠杆菌D册a菌株，在表面涂有氨卞青霉素（lOOiig/ mU的LB平板上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基中培养过夜。
[002引 （5)质粒DNA的提取:碱法提取质粒DNA。
[0029] (6)序列测定:DNA双脱氧法测定核巧酸序列，在上海生物工程有限公司进行。序列 引物为M13启动子引物。疏绵状嗜热丝抱菌TLAA9-2基因 cDNA全长82化P，包含起始密码子和 终止密码子，无内含子，编码252个氨基酸。将此氨基酸序列在国际基因库中进行检索，发现 属于多糖单加氧酶第AA9家族。该序列如下：
[0030] (A)沈Q ID NO 1 的信息
[0031] (a)序列特征:*长度:825碱基对;*类型：核酸;*链型:双链;*拓扑结构:线性
[0032] (b)分子类型：DNA
[003；3] (C)假设：否
[0034] (d)反义：否
[0(X3日](e)最初来源:疏绵状嗜热丝抱菌化ermomyces lanuginosus [0036] (f)序列描述：
[003引 （B)沈Q ID NO 2的信息
[0039] (a)序列特征:*长度:252氨基酸;*类型:氨基酸;*链型:单链;*拓扑结构:线性
[0040] (b)分子类型：蛋白质
[OOW (C)序列描述：
[00421
[0043] 实施方式3:表达载体的构建
[0044] (1)将目的基因 CDS序列进行信号肤分析预测，去除信号肤，根据载体信息设计引 物，引入化oil和Xbal酶切位点，并补全序列至化iczaA载体的Kex2蛋白信号切割位点，反向 引物3'端去除终止密码子并添加两个碱基W保证序列正常翻译至6X化S标签。
[0045] 上游引物：5 ' -AGGGGTATCTCTCGAGAAAAGACACGGGTTTGTCTCCAACCT-3 '
[0046] 下游引物：5 ' -GAGTTTTTGTTCTAGACCCGCCGCCGCCGGCGTCG-3 '
[0047] (2)疏绵状嗜热丝抱菌总RNA的提取:利用Trizol试剂提取。
[004引 （3)反转录合成cDNA第一条链:取化g总RNA，加入5X反应缓冲液化L，10mM dNTP 2 化，核糖核酸酶抑制剂(40-200uAiL)0.扣L引物oligodT(化g/化）化L，反转录酶（1011/化)2 化，42 °C反应60min，然后85 °C lOmin终止反应，稀释至200化。
[0049] (4)PCR 反应（2 化L):cDNA 化L，10XBuffer 2.化L，10mmol/L dNTP 化L，25mmol/ LMgCl2化L，上、下游引物各化L，化q DM聚合酶0.扣L(抓/化），dd出0 1化L。反应条件为94°C 5min 预变性;941：4〇3,561：4〇3,72°(：1111111，共32个循环，72°(：延伸1〇111111，4°(：保存。
[0050] (5)基因克隆：取化L PCR产物与PMD18-T载体进行连接，获得重组质粒PMD18T/ TLAA9-2操作步骤按TAKARA公司产品说明书进行。然后连接产物转化大肠杆菌D册a，在涂有 AMP的LB平板上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基中培养过夜。
[0051 ] (6)质粒DNA提取:碱法提取质粒DNA。
[0化2] (7)用化oil和Xbal对重组质粒PMD18-T/TLAA9-2产物进行双酶切，同时用化oil和 Xbal双酶切酵母表达质粒pPICZaA，DNA胶回收试剂盒回收纯化TLAA9-2基因及载体pPICZa A片断。然后进行体外连接，获得重组质粒pPICZaA/TLAA9-2，重组质粒转化大肠杆菌JM109， 在含Amp的LB转化平板上挑选单菌落，提取质粒DNA，进行PCR和酶切鉴定，测序确认重组质 粒的读码框正确。
[0053]实施例4.表达多糖单加氧酶基因 TLAA9-2的酵母工程菌株的构建及筛选 [0化4] (1)重组表达质粒的线性化：将重组表达质粒pPICZaA/化AA9-2用限制性内切酶 Sac I线性化。
[0化5] (2)转化：电击转化酵母菌株Pichia pastoris GS115酵母感受态细胞，转化方法 参见Invitrogen公司毕赤酵母操作手册。
[0056] (3)筛选：用灭菌牙签挑取转化子对应点种在Zeocin平板上，28°C培养2-4d，挑取 在Zeocin平板上均生长良好的转化子为阳性转化子。挑取阳性转化子分别点种于高浓度博 来霉素平板上筛选多拷贝转化子。
[0化7] 实施方式5:毕赤酵母Pichia pastoris GS115的诱导表达和活性检测 [0化引 （1)将阳性转化子接种于含25mL BMGY培养基中，30°C20化pm/min摇床培养24h (0060(値达到1.8)，离屯、收集菌体，将细胞重悬于适当体积的BMMY培养基中，至OD600值为1.0， 28°C200rpm/min继续培养，每24h补充甲醇至终浓度为0.5 %，每24h取样，室溫10，OOOg离屯、 5min，取上清进行SDS-PAGE分析。
[0059] (2)酶活性检测：酶活性测定采用酶解产物薄层层析法，反应体系及反应条件为 100化的酶液，加入20化L的0.5%憐酸膨胀纤维素，100化的醋酸缓冲液(0.2mol/L、抑5.0) 50°C反应48h，离屯、后取上清3ul到层析板上，展层后喷洒显色液，85度20min观察结果。蛋白 含量测定采用化a壯ord法。
[0060] (3)重组多糖单加氧酶TLAA9-2的最适反应溫度:诱导表达的重组多糖单加氧酶经 过GE公司的化sTrap FF crude金属配体亲和层析柱纯化带有组氨酸标记的重组蛋白质，获 得电泳均一的纯化蛋白，用纯化的重组多糖单加氧酶测定其性质。在相同PH(K1 = 5)不同 的溫度条件下（30°C，40°C，50°C，60°C，70°C，80°C，90°C)多糖单加氧酶反应36h，然后分别 加入纤维素酶，50 °C下反应半小时，DNS法测量产生的还原糖的量。数值测量S次求平均值， 将最高的酶活力定义为100%。
[0061] 实施方式6:AA9家族多糖单加氧酶TLAA9-2对内切纤维素酶N24活性的促进作用
[0062] (1 )AA9家族多糖单加氧酶TLAA9-2对内切纤维素酶N24活性的促进作用
[0063] 采用DNS法，多糖单加氧酶在PH = 5,溫度50°C，200RPM的条件下，设置两组多糖单 加氧酶与纤维素反应36h，一组加入纤维素酶，一组不加纤维素酶，50°C下反应30min，反应 体系为：TLAA9-250化，N2450化，200化的0.5%憐酸膨胀纤维素，100化的醋酸缓冲液 (0.2mol/L、pH 5.0)，加入400化DNS试剂，煮沸lOmin，在540nm波长下测定光吸收值。W不 加多糖单加氧酶化AA9-2的反应体系中的酶活性定义为100%，分别计算多糖单加氧酶 TLAA9-2、内切纤维素酶N24W及混合酶的相对酶活性。重复S次，取平均值。
[0064] (2)供电子体(抗坏血酸)对多糖单加氧酶TLAA9-2纤维素酶活性的影响
[00化]设置两组反应体系，一组加入抗坏血酸，使其终浓度为lOmM，另一组不加抗坏血 酸，在多糖单加氧酶TLAA9-2最适反应条件下测定其氧化裂解纤维素酶活性，反应4她后，娃 胶薄层层析分析产物，测定活性。
[0066] 实施方式7: AA9家族多糖单加氧酶酶解产物飞行质谱分析
[0067] 将AA9家族多糖单加氧酶TLAA9-2与憐酸膨胀纤维素混合在PH = 5的醋酸安缓冲液 中，在最适溫度条件下反应4她，取上清做飞行质谱。AA9家族多糖单加氧酶TLAA9-2氧化裂 解产生的多糖有多种形式，主要有C1和C4氧化，还可能有C6氧化。C1氧化C6氧化C4水和产物 的分子量均增加16,而C4氧化分子量变化为2。飞行质谱测的的分子量减去对应寡糖的分子 量再减去氧化减少的碳原子的数量和结合钢离子的数量为氧化后的产物分子量。
[0068] 实施方式8:表达TLAA9-2基因的毕赤酵母工程菌株GS-CT-9-2的保藏
[0069] 表达TLAA9-2基因的毕赤酵母工程菌株GS-CT-TLAA9-2的保藏单位：中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中屯、（CGMCC);地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国 科学院微生物研究所;保藏日期：2016年4月21日；酵母工程菌株编号为:CGMCC No . 12384; 毕赤酵母工程菌株的分类命名为:己氏毕赤酵母Pichiapastoris。
【主权项】
1.一种表达疏绵状嗜热丝孢菌Thermomyces lanuginosusAA9家族多糖单加氧酶基因 TLAA9-2的酵母工程菌株，其特征在于该菌为一种毕赤酵母，通过RT-PCR方法从疏绵状嗜热 丝孢菌Thermomyces lanuginosus获得热稳定AA9家族糖苷水解酶基因 TLAA9-2，将该基因 克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pPICZaA，获得表达重组质粒pPICZaA/TLAA9_2,转化毕赤 酵母GS115,从中筛选出表达热稳定多糖单加氧酶基因 TLAA9-2的毕赤酵母工程菌株GS-CT-9-2，该糖苷水解酶TLAA9-2对内切纤维素酶的活性具有明显的促进作用，并且能够将磷酸 膨胀纤维素氧化裂解为纤维寡糖，飞行质谱结果鉴定裂解纤维素长链主要产物为纤维寡 糖。
【文档编号】C12N1/19GK106047737SQ201610366951
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年5月26日
【发明人】李多川, 耿志刚, 陈铭
【申请人】山东农业大学