一种龙眼肉蛋白多糖的检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于食品检测领域，尤其涉及一种龙眼肉蛋白多糖的检测方法。
【背景技术】
[0002]龙眼(Dimocarpus longan Lour.)俗称桂圆，属于无患子科龙眼属常绿乔木，主要的商业种植在中国、泰国和越南。我国龙眼的种质资源丰富，种植面积和产量均居世界首位。由于龙眼果实采收季节性强且贮藏保鲜难度大，鲜果约70 %在产地鲜销，其余主要加工为干果、果脯和果汁等，经济附加值较低。精深加工对龙眼产业的高效、持续发展十分迫切。
[0003]作为卫生部法定的药食同源水果，龙眼在我国民间和传统中医中多用于治疗或改善气血不足、心悸怔忡、失眠健忘、贫血、脾虚泄泻等症状，其功能活性成分的研宄开发在食品、生物和医药领域引起广泛关注。蛋白多糖是重要的生物大分子，在现代药理学研宄中表现出免疫调节、抗肿瘤、抗氧化和抗炎症等多种功能活性。龙眼干果肉中蛋白多糖含量高达35%,碳水化合物部分主要由(I — 6) - a -D-Glcp、(I — 4) - β -D-Manp> (I — 4) - β -D-Rhap和(I —5)-α-L-Araf等糖苷键组成，结合蛋白含量约5%。蛋白多糖是龙眼肉免疫调节的主要物质基础，能显著增强免疫抑制和正常小鼠的免疫系统功能，并能在体外直接刺激脾淋巴细胞和巨噬细胞活化。龙眼肉蛋白多糖作为天然免疫调节功能因子具有广阔的开发利用前景。目前关于龙眼肉蛋白多糖的研宄主要集中在提取分离、结构解析和活性评价，而对于其定量和定性检测方法研宄则未见报道。
[0004]现有技术存在的冋题是:
[0005](I)传统的蛋白多糖定量检测方法是通过苯酚-硫酸法或蒽酮-硫酸法测定其多糖含量，再换算相应蛋白多糖含量。该类化学分光光度法方法虽然操作简单，但极易受还原糖、低聚糖和其他多糖存在的干扰，而常用的样品处理方法(如醇沉法和凝胶层析法等)也很难消除相近分子量的高分子碳水合物的干扰。
[0006](2)传统的蛋白多糖定性检测方法主要通过分子排阻色谱和示差检测器相结合测定其分子量分布，该方法需要较高的目标物质浓度(即检出限低)，且相近分子量的高分子物质都可能对检测造成干扰。
[0007](3)关于龙眼肉蛋白多糖的定性定量检测方法尚未见报道。
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于提供一种龙眼肉蛋白多糖的检测方法，旨在解决现有的蛋白多糖的定性定量检测方法检出限高、灵敏度低、专一性不强的问题。
[0009]本发明是这样实现的，一种龙眼肉蛋白多糖的检测方法包括:
[0010]步骤一、取龙眼干果肉，加蒸馏水进行匀浆处理，龙眼肉匀浆保温浸提后，抽滤分离滤液；滤液浓缩后，转入截留分子量为3500的透析袋中，置于蒸馏水中低温透析；透析袋内溶液真空浓缩后冷冻干燥，得到龙眼粗蛋白多糖粉末；
[0011]步骤二、取龙眼粗蛋白多糖溶于蒸馏水中，充分溶解后离心后取上清液加入Sephadex G-1OO凝胶柱中，并以蒸馏水洗脱，采用苯酚硫酸法测定洗脱液中的多糖含量，测定洗脱液在280nm处的吸光值以表征其蛋白含量，收集合并同时出现多糖和蛋白信号的洗脱液，冷冻干燥得到龙眼肉蛋白多糖的纯品；
[0012]步骤三、取龙眼粗蛋白多糖溶于碳酸钠缓冲液中，加入异硫氰酸荧光素，于室温下避光搅拌反应，反应结束后，离心取上清液加入Sephadex G-100凝胶柱中，并以蒸馏水洗脱，采用苯酚硫酸法测定洗脱液中的多糖含量，并分别测定洗脱液在280nm和489.5nm处的吸光值以表征其蛋白和荧光素含量，收集合并同时出现多糖、蛋白和荧光素信号的洗脱液，冷冻干燥得到荧光标记龙眼肉蛋白多糖的纯品；
[0013]步骤四、采用硝酸钠溶液配制系列浓度的荧光标记龙眼肉蛋白多糖样液，分别经0.45 μπι微孔滤膜过滤后采用液相色谱仪结合荧光检测器分析，进行荧光标记龙眼肉蛋白多糖的标准曲线测定；
[0014]步骤五、以多糖浓度与峰面积对数对建立标准曲线进行定量分析，以响应峰的保留时间进行分子量的定性分析。
[0015]进一步，步骤一所述的龙眼肉匀浆在90°C下保温浸提2小时。
[0016]进一步，步骤一所述的滤液在60°C下真空浓缩后，转入截留分子量为3500的透析袋中，置于大量4°C蒸馏水中低温透析12小时。
[0017]进一步，在步骤三中，龙眼粗蛋白多糖溶于0.5mol/L的pH为8.3的碳酸钠缓冲液中，加入异硫氰酸荧光素后于室温下避光搅拌反应24小时。
[0018]进一步，步骤四中采用0.lmol/L的硝酸钠溶液配制系列浓度为0.5 - 200 μ g/mL的多糖样液。
[0019]异硫氰酸荧光素(FITC)能特异结合龙眼肉蛋白多糖分子中的结合蛋白，赋予蛋白多糖稳定的荧光特征，保障了定量检测的可行性和检测目标的专一性。采用高效分子排阻色谱结合荧光检测器(HPSEC-FD)分析检测龙眼肉蛋白多糖:结合蛋白多糖浓度和峰面积对数建立标准曲线，在I?200 μ g/mL的浓度范围内线性关系良好，能实现龙眼蛋白多糖的定量分析，最低检出限为0.25 μ g/mL,最低定量限为0.85 μ g/mL ；同时结合峰响应的保留时间，能有效表征蛋白多糖的分子量分布，达到对目标物质的定性分析。本发明的方法不仅能同时实现蛋白多糖的定性定量检测，而且方法检出限低、灵敏度高、专一性强。
【附图说明】
[0020]图1是本发明实施例提供的一种龙眼肉蛋白多糖的检测方法流程图；
[0021]图2是本发明实施例提供的标记前的龙眼肉蛋白多糖的凝胶过滤层析图；
[0022]图3是本发明实施例提供的标记后的龙眼肉蛋白多糖的凝胶过滤层析图；
[0023]图4是本发明实施例提供的荧光标记龙眼蛋白多糖检测的标准曲线；
[0024]图5是本发明实施例提供的龙眼肉蛋白多糖及其荧光标记物的HPSEC-FD色谱图。
【具体实施方式】
[0025]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0026]下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。
[0027]请参阅图1至图5:
[0028]本发明是这样实现的，一种龙眼肉蛋白多糖的检测方法包括:
[0029]S101、取50g龙眼干果肉，加入400mL蒸馏水进行匀浆处理；龙眼肉匀浆在90°C下保温浸提2h后，抽滤分离滤