一种高压脉冲电场偶联生物酶解制备鲍鱼内脏磷脂的方法与流程

本发明属于水产食品精深加工领域，涉及鲍鱼内脏有效成分的提取，特别涉及一种高压脉冲电场偶联生物酶解制备鲍鱼内脏磷脂的方法，同时得到蛋白、多糖和色素。

背景技术：

鲍鱼（abalone）又名鳆、鳆鱼，是种单壳软体具有很高营养价值的海洋贝类。每1000 g新鲜鲍肉中含蛋白质350~500 g、碳水化合物240~380 g、脂质80~220 g，并含有多种的维生素与微量元素。《本草纲目》中记载，鲍鱼性平，味甘、咸，有明目补虚、清热滋阴、养血益胃、滋补肝肾的作用，是一种具有较高营养价值与药用价值的海产品之一。

2011年我国的鲍鱼年产量达到6.5万吨，2015年达到12.8万吨，鲍鱼产业增长迅猛。长期以来，我国的鲍鱼深加工与使用大部分以腹足为主，在加工过程中，占鲍鱼总重量约25%左右的内脏被丢弃，极少部分被加工成饲料。鲍鱼内脏中含有丰富的蛋白质、脂质、碳水化合物和维生素等营养素及一些生物活性物质，大量的鲍鱼内脏被丢弃，得不到充分利用，不仅造成经济损失，而且给环境带来污染。

目前对鲍鱼内脏的研究主要集中在牲畜饲料的加工，对其营养价值与药用价值的开发较少。鲍鱼内脏中含较多磷脂，能显著提高人体免疫力、提高大脑活力，并且能有效防治高血脂、高血压等心脑血管疾病；鲍鱼内脏中的多糖具有抗氧化、抗肿瘤、增强机体免疫等活性；鲍鱼内脏中的胶原蛋白具有良好的降血压功能、预防关节炎功能、保护胃粘膜以及促进皮肤胶原代谢等功能；因此，鲍鱼内脏具有很强的营养、药用开发价值与潜力。

公开号为CN 101912027A的发明专利“一种复合酶解鲍鱼内脏制备蛋白水解液的方法”公开了一种以鲍鱼内脏为原料，通过碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶的复合酶解、乙基麦芽酚屏蔽苦味等技术制备了蛋白水解液。该发明制备的蛋白质水解液富含氨基酸、营养丰富、风味鲜美，但仅对鲍鱼内脏中单一成分进行利用，未能显著提高鲍鱼内脏的经济价值。公开号为CN 103255186A的发明专利“鲍鱼多糖、脂质和蛋白肽的联产制备方法”，是以鲍鱼内脏为原料，通过复合酶解、膜分离、醇沉等手段提取制备鲍鱼多糖、脂质和蛋白肽，改进了传统技术对原料利用不充分的缺点，但制备得到的组分较为单一，纯度不高，脂质与蛋白多肽尚未完全分离，制备效率低，且未能充分利用鲍鱼内脏残渣，不足以最大化实现鲍鱼内脏的高值化利用，造成一定程度的资源浪费。

高压脉冲电场（Pulsed Electric Field，简称PEF），PEF技术能增加细胞渗透性，提高被提取物质的溶出，偶联生物酶解可有效提高鲍鱼内脏有效成分溶物，增加其有效利用率。因此，PEF偶联生物酶解技术开发一种鲍鱼内脏磷脂提取与综合利用的方法，不仅能制备鲍鱼内脏磷脂，同时得到鲍鱼内脏中性磷脂、糖脂、色素、蛋白、粗多糖等单一成分，且有效解决鲍鱼内脏残渣的问题，提高鲍鱼内脏活性成分的制备率，实现鲍鱼内脏的高值化利用，减少环境污染、节约加工成本，同时实现鲍鱼内脏的回收利用，大大提高鲍鱼加工业的产值，从而带动与促进海产品加工业的发展。

技术实现要素：

本发明目的在于针对现有技术存在的问题提供一种鲍鱼内脏磷脂提取和综合利用的方法，本方法以鲍鱼加工过程中的副产物——鲍鱼内脏为原料，主要通过PEF偶联生物酶解技术制备鲍鱼内脏中磷脂，同时得到蛋白、多糖和糖脂等单一组分，并解决鲍鱼残渣的问题。以解决上述技术存在的问题并实现鲍鱼产业的高值化利用，从而减少鲍鱼副产物的资源浪费，提高鲍鱼加工业的附加值，实现资源的回收利用。

为实现上述目的，本发明提供一种鲍鱼内脏磷脂提取与综合利用的方法，主要包括以下步骤：

1）原理预处理：将清洗干净的鲍鱼内脏按固液重量比1：5~1：10加入蒸馏水，并用高速组织捣碎机，转速10000r/min将其打浆；

2）PEF与酶解：绞成浆后的鲍鱼内脏置于配料缸，进行15~20 min的高压脉冲电场处理；用0.2 M PBS缓冲溶液调pH至5.5~8.0，加入复合蛋白酶，40~55 ℃酶解1~3 h，90℃灭酶10~20 min；4000 rpm离心10~20 min收集鲍鱼内脏提取物的上清液A，不溶物经60~70 ℃的热风干燥加工成适宜牲畜饲料；

3）脂质提取：用正己烷浸提2）收集到的上清液A，萃取得到鲍鱼总脂和水溶液B；总脂用3~6倍体积丙酮洗涤，得到丙酮不溶物用少量甲醇溶解，-20 ℃备用；

4）磷脂分离：将3）提取到的丙酮不溶物装入制备硅胶层析柱，分别用8~12倍体积的氯仿、丙酮和甲醇冲洗，收集洗脱液，进行旋蒸；

5）蛋白分离：调节步骤3）收集到的水溶液B的pH至5.0~5.5，4000 rpm离心10-20 min沉淀蛋白，冷冻干燥，备用；收集上清液C；

6）鲍鱼多糖提取：将步骤5）获得的上清液C浓缩，按3-8倍体积加入95wt%乙醇，4 ℃下沉淀10~12 h，4000 rpm离心10~20 min获得多糖沉淀；将多糖重新溶解于蒸馏水，95wt%乙醇反复醇沉3-5次，收集沉淀物，冷冻干燥得到鲍鱼多糖；

所述PEF处理参数：电场强度20~40 KV/cm，脉冲时间350~450μS，脉冲频率200-400Hz；

所述复合蛋白酶：AS.1398中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的一种或多种组合，总添加量为原料重量的0.1~1%；

所述磷脂分离是在步骤3）中经萃取得到鲍鱼内脏总脂，以甲醇为洗脱液经硅胶柱层析分离得到磷脂，同时使用氯仿、丙酮作为洗脱液，得到中性脂肪、糖脂和色素；

所述工艺步骤在PEF处理后，鲍鱼内脏遭到不可逆破坏，细胞通透性增大，内容物溶出；经蛋白生物酶解，硅胶柱层析技术可得到纯度较高的磷脂，同时还制备得到鲍鱼内脏的中性脂肪、糖脂和色素；经过蛋白析出、多糖醇沉可分离得到鲍鱼内脏粗蛋白和多糖，有效提高鲍鱼内脏提取物得率；

所述工艺步骤制备得到鲍鱼内脏磷脂、糖脂、色素蛋白、多糖和磷脂或其中的任意一个产品，并将鲍鱼内脏残渣加工成适宜牲畜食用的饲料。

上述分步制备鲍鱼内脏磷脂与鲍鱼内脏的综合利用，采用PEF偶联生物酶解技术，通过硅胶柱层析制备鲍鱼内脏磷脂，同时得到糖脂和色素等；鲍鱼蛋白通过等电点沉淀析出、多糖醇沉得到鲍鱼内脏蛋白、粗多糖，相比于现有鲍鱼加工业技术至少具有下列有点：

1. 该发明利用PEF偶联生物酶解技术、硅胶柱层析制备技术等实现了鲍鱼内脏中磷脂、蛋白和多糖等多种单一组分的高效提取，减少鲍鱼加工过程中副产物的排放，提高制备效率，实现节约成本、节省能耗，提高鲍鱼的附加值；

2. 该发明绿色加工技术，制备得到的鲍鱼内脏磷脂、蛋白、多糖和色素等来源安全、无毒，无化学试剂的污染，符合国家食品安全标准，可广泛应用于食品加工中的功能性食品以及药用加工等领域；

3. 该发明不仅解决鲍鱼内脏中营养与药用成分的提取，且将鲍鱼不溶物经60~70 ℃热风干燥加工成适宜牲畜食用的饲料，形成较为完整的生产体系，易产业化；

4. 该发明可有效应用于鲍鱼加工业中副产物的回收利用，可形成鲍鱼内脏副产物的加工生产线，提高产业附加值，带动海产品加工业大发展；

5. 该发明实现副产物鲍鱼内脏废物资源化，设备简单，操作简便，生产工艺条件较易控制，具有良好的实用性和应用前景。

附图说明

图1为本发明PEF与生物酶解偶联方法制备鲍鱼内脏磷脂的工艺流程图。

具体实施方式

为更好地理解本发明，以下结合具体实施例来进一步说明本发明的技术方案，但以下实施例仅属于本发明范畴，却并不局限于此。

实施例1

一种PEF与生物酶解偶联制备鲍鱼内脏磷脂的方法包括以下步骤：

1）原理预处理：将500 g清洗干净的鲍鱼内脏按1：5的固液重量比比加入蒸馏水，并用高速组织捣碎机，转速10000r/min将其打浆；

2）PEF与酶解：绞成浆后的鲍鱼内脏置于配料缸，进行17 min的高压脉冲电场处理，电场强度30 KV/cm，脉冲时间378 μS，脉冲频率296 Hz；然后用0.2 M PBS缓冲溶液调pH至6.8，加入比例为AS.1398中性蛋白酶：木瓜蛋白酶：胰蛋白酶=1：1：1的复合蛋白酶3 g，在45 ℃下酶解2 h，90 ℃灭酶15 min；4000 rpm离心13 min收集鲍鱼内脏提取物的上清液A 2255 mL，不溶物经65 ℃的热风干燥加工成适宜牲畜食用的饲料 251 g；

3）磷脂提取：将步骤2）收集到的上清液A静置12 h，萃取上层油状液体，得到鲍鱼总脂质83 g；用200 mL丙酮洗涤得到丙酮不溶物43 g，用10ml甲醇溶解丙酮不溶物，然后分别以100 mL甲醇、100 mL氯仿、100 mL丙酮为洗脱液通过硅胶层析柱制备得到16.6 g磷脂、19.1 g糖脂和0.92 g色素；

4）蛋白质分离：将步骤3）萃取去总脂质后的水溶液B调节pH至5.17，4000 rpm离心15 min收集上清液C 1762 mL；沉淀通过冷冻干燥，得到白色蛋白118 g；

5）鲍鱼多糖提取：将步骤4）获得的上清液C浓缩至500 mL，按4倍体积加入95wt%乙醇，4 ℃下沉淀11 h，4000 rpm离心15 min获得多糖沉淀，将初次醇沉得到的多糖重新溶解于200 mL蒸馏水，加入500 mL 95wt%乙醇反复醇沉3次，收集沉淀物，冷冻干燥得到鲍鱼多糖103 g；

鲍鱼内脏含有约蛋白350~500 g、碳水化合物240~380 g、脂质80~220 g。通过PEF偶联生物酶解技术提取鲍鱼内脏活性成分，可依次提取到磷脂16.6 g，19.1 g糖脂和0.92 g色素，蛋白118 g，多糖103 g，说明一种鲍鱼内脏磷脂提取与综合利用的方法能有效提取鲍鱼内脏活性成分。

实施例2

一种PEF与生物酶解偶联制备鲍鱼内脏磷脂的方法包括以下步骤：

1）原理预处理：将500 g清洗干净的鲍鱼内脏按加入4000 mL蒸馏水，并用高速组织捣碎机，转速10000r/min将其打浆；

2）PEF与酶解：绞成浆后的鲍鱼内脏置于配料缸，进行20 min的高压脉冲电场处理，电场强度34 KV/cm，脉冲时间450 μS，脉冲频率312 Hz；然后用0.2 M PBS缓冲溶液调pH至6.3，加入比例为AS.1398中性蛋白酶：木瓜蛋白酶：胰蛋白酶=1：0.5：0.8的复合蛋白酶5 g，在45 ℃下酶解2.5 h，90 ℃灭酶15 min；4000 rpm离心15 min收集鲍鱼内脏提取物的上清液A 3180 mL，不溶物经65 ℃的热风干燥加工成适宜牲畜食用的饲料 293 g；

3）磷脂提取：将步骤2）收集的上清液A静置15 h，萃取上层油状液体，得到鲍鱼总脂质76.5 g；用350 mL丙酮洗涤得到丙酮不溶物41.6 g，用15ml甲醇溶解丙酮不溶物，然后分别以150 mL甲醇、150 mL氯仿、150 mL丙酮为洗脱液通过硅胶层析柱制备得到16.1 g磷脂、17.8 g糖脂和0.85 g色素；

4）蛋白质分离：将步骤3）萃取去总脂质的上清液B调节pH至5.17，4000 rpm离心15 min收集上清液C 3310 mL；沉淀通过冷冻干燥，得到白色蛋白112 g；

5）鲍鱼多糖提取：将步骤4）获得的上清液C浓缩至500 mL，加入3000 mL 95wt%乙醇，4 ℃下沉淀13 h，4000 rpm离心15 min获得鲍鱼内脏粗多糖；将初次醇沉得到的粗多糖重新溶解于150 mL蒸馏水，加入450 mL 95wt%乙醇反复醇沉5次，收集沉淀物，冷冻干燥得到鲍鱼多糖107 g；

分别称取500 g清洗干净的鲍鱼内脏按加入4000 mL蒸馏水，并用高速组织捣碎机，转速10000r/min将其打浆。① 将浆体静置2.5 h，抽滤除去鲍鱼内脏水不溶物，并将其进行热风干燥；滤液操作与本实施例2的步骤（3）~（5）一致；② 将浆体置于功率350 W、频率28 KHz、温度45 ℃下超声辅助提取10 min，并静置2.67 h，抽滤除去鲍鱼内脏水不溶物，并将其进行热风干燥；滤液操作与本实施例2的步骤（3）~（5）一致；③ 将浆体静置十分钟，然后用0.2 M PBS缓冲溶液调pH至6.3，加入比例为AS.1398中性蛋白酶：木瓜蛋白酶：胰蛋白酶=1：0.5：0.8的复合蛋白酶6 g，45 ℃酶解2.5 h，90 ℃灭酶15 min；滤液操作与本实施例2的步骤（3）~（5）一致。分别根据①②③和PEF偶联生物复合酶解技术提取鲍鱼内脏活性成分与鲍鱼内脏水不溶物，结果如表1所示。

表1 不同方法制备鲍鱼内脏活性成分对比

由表1可知，溶剂提取、超声辅助提取以及生物酶解均能制备得到鲍鱼内脏活性成分。其中溶剂静置提取磷脂、蛋白、多糖、糖脂和色素等提取率较低，大多只被加工成适宜牲畜食用的饲料；超声辅助提取与生物酶解是提取工艺中常用方法，能在单一溶剂提取的基础上显著提高提取物质的提取率，一定程度上解决鲍鱼内脏废弃的问题，节约了能耗。相比于单一的活性成分制备技术，PEF偶联生物酶解技术最大程度利用了鲍鱼内脏的回收问题，不仅提取到含量较多的鲍鱼内脏磷脂、蛋白、多糖、糖脂和色素，且对鲍鱼内脏水不溶物加工成适宜牲畜食用的饲料，既节省了能耗、实现资源的再度分配，且制备得到安全、无毒的鲍鱼内脏蛋白、多糖和磷脂等活性成分可应用于食品、医药等领域的生产加工中，如作为添加剂应用于功能性食品加工，药用物质的开发等，极大提高鲍鱼加工业的附加值，带动海产品加工的发展。

上述仅为本发明的较佳实施例，但本发明的设计与构思并不局限于此。凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆属于侵犯本发明范畴的行为。