一种增强细胞活性的新方法与流程

本发明涉及生物医药领域，具体的，本发明涉及提高细胞活性的方法。

背景技术：

皮肤可分表皮、真皮及皮下组织三层，其中真皮层是由细胞和细胞外基质共同构成，成纤维细胞是真皮层的主要细胞，其正常的增殖、分化维系着皮肤正常的结构和生理功能；细胞外基质是由细胞合成并分泌、围绕细胞相互作用的一类大分子物质，主要由四大类分子组成：胶原、弹性蛋白、糖蛋白及蛋白多糖。胶原纤维、网状纤维和弹性纤维通过一定方式相互作用，交织成网，埋于以透明质酸为主要成分形成的凝胶状基质中。在皮肤创伤愈合的过程中，成纤维细胞会大量增殖并分泌胶原等细胞外基质以及细胞因子成分，进一步复合血管结构形成类似真皮层的组织。因此在皮肤创伤愈合的过程中，成纤维细胞的活化将对创面修复起到重要的调控作用。

皮肤作为人体的最大器官，具有屏障、保护、调节体温和感觉的功能。由于炎症、溃疡、烫伤、烧伤等因素造成的皮肤缺损，严重的可危及生命。目前临床通常采用自体皮瓣或皮肤移植的方法治疗缺损创面，但面临供皮区新的创伤缺陷以及供皮区来源不足等问题；此外移植物与移植部位临近的皮肤也存在颜色、质地、功能上的差异。因此，如何有效开展皮肤损伤创面的修复仍是人们不断探求和解决的问题。

技术实现要素：

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明提出了一种可以用于创伤修复的提高细胞活性的方法，该方法具有免疫原性低、见效快、自然性、效果持久、风险低的优势。

在本发明的第一方面，本发明提出了一种提高细胞活性的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：将目标细胞与间充质干细胞以及填充剂进行接触，其中，所述填充剂包括选自胶原蛋白、透明质酸、钙羟基磷灰石(微晶瓷)、聚乳酸和富血小板血浆的至少之一。利用根据本发明实施例的方法提高细胞，如成纤维细胞的活性、创伤修复，相比于现有技术，克服了自体皮肤移植见效慢、效果不稳定的缺陷。此外，根据本发明实施例的提高细胞活性的方法，填充剂与间充质干细胞联合使用，填充剂可以将间充质干细胞维持在一定的空间和体积范围内，不仅可以起到保护和润滑细胞的作用，还能够提高该范围内有效因子的作用浓度，更高效的促进目标细胞活性的增加。根据本发明实施例的提高细胞活性的方法具有免疫原性低、见效快、自然性、效果持久、风险低的优势。

根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。脐带间充质干细胞来源广泛，免疫原性更低，用药更加安全，且脐带间充质干细胞自身能够分泌胶原蛋白并进一步分泌包括SCF、bFGF、VEGF、IGF等在内的因子，刺激真皮层中成纤维细胞存活与增殖并进一步分泌胶原蛋白、透明质酸和弹性纤维。此外，脐带间充质干细胞还可以进一步以旁分泌方式产生多种血管生成因子，促进形成新的毛细血管网；不仅如此，脐带间充质干细胞在一定条件下也可转化为内皮细胞参与微血管的形成，起到营养真皮及皮下相关细胞的作用，本发明实施例的方法用于提高细胞活性更加持久、有效。

根据本发明的实施例，所述间充质干细胞为P1～P6代间充质干细胞。发明人通过实验发现，大于P6代的间充质干细胞细胞状态不如早代次的细胞、分泌的细胞因子量也有所减少，P1～P6代间充质干细胞本身状态良好、细胞活性和因子分泌较强，用于提高细胞活性效果更佳。

根据本发明的实施例，所述间充质干细胞以悬浮于培养基、悬浮于生理盐水或贴壁培养于培养基中的形式提供的。根据本发明的实施例，所述间充质干细胞以上述三种形式的其中一种提供，可保持间充干细胞的良好细胞状态。

根据本发明的实施例，所述间充质干细胞以悬浮于培养基或悬浮于生理盐水中的形式提供，所述间充质干细胞的密度为0.1*10⁶-10*10⁶个/ml。发明人通过实验发现，间充质干细胞在培养基或生理盐水中的悬浮密度为0.1*10⁶-10*10⁶个/ml，可进一步保证间充质干细胞的良好状态并提供合适大小的体积比，进而使得本发明实施例的方法用于提高细胞活性的效果更佳。

根据本发明的实施例，所述培养基或所述生理盐水与所述填充剂的体积比为1:0.5～1:5。发明人发现，间充质干细胞在培养基或生理盐水中的悬浮密度为0.1*10⁶-10*10⁶个/ml，培养基或生理盐水与填充剂的体积比为1:0.5～1:5，使得本发明实施例的用于提高细胞活性的方法的效果更佳。

根据本发明的实施例，所述间充质干细胞以贴壁培养于培养基中的形式提供，所述间充质干细胞的贴壁密度为1*10⁴～3*10⁴个/cm²。发明人通过实验发现，间充质干细胞贴壁培养于培养基中，贴壁密度为1*10⁴～3*10⁴个/cm²，可进一步保证间充质干细胞的良好状态，进而使得本发明实施例的方法用于提高细胞活性的效果更佳。

根据本发明的实施例，所述培养基与所述填充剂的体积比为1:0.5～1:5。发明人发现，培养基与填充剂的体积比在1:0.5～1:5范围内，所述方法在提高细胞的活性上效果更加显著。

根据本发明的实施例，所述目标细胞、所述间充质干细胞的个数比为1：0.1～1：10。发明人发现，目标细胞、间充质干细胞的个数比在1:0.1～1：10范围内，对提高目标细胞的活性更加快速、有效。

附图说明

图1是根据本发明实施例的脐带间充质干细胞的形态图；以及

图2是根据本发明实施例的通过流式细胞检测鉴定所选择的脐带间充质干细胞的表面标志物的结果图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

提高细胞活性的方法

在本发明的第一方面，本发明提出了一种提高细胞活性的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：将目标细胞与间充质干细胞以及填充剂进行接触，其中，所述填充剂包括选自胶原蛋白、透明质酸、钙羟基磷灰石(微晶瓷)、聚乳酸和富血小板血浆的至少之一。利用根据本发明实施例的提高细胞活性的方法，以用来创伤修复，相比于现有技术，克服了自体成纤维细胞移植见效慢、效果不稳定的缺陷。根据本发明实施例的方法采用间充质干细胞，免疫原性低。填充剂，以透明质酸为例，具有吸水性、高负电荷性质、生物相容性及在创伤愈合中的生物活性等，逐渐应用于创面敷料和组织工程等皮肤创伤治疗领域。透明质酸参与皮肤创伤愈合的炎症、增殖和重建期。其中在增殖期，短链透明质酸(含6～20个单糖)可促进成纤维细胞迁移至创伤组织，成纤维细胞产生胶原和糖胺聚糖(GAG)，构建新的细胞外基质(ECM)；此外，透明质酸还可促进血管生成和角质形成细胞的增殖和迁移，进一步促进皮肤创伤的愈合。间充质干细胞和包括胶原蛋白、透明质酸、钙羟基磷灰石(微晶瓷)、聚乳酸和富血小板血浆的至少之一复合使用，可修复创伤，不破坏皮肤原本结构。利用间充质干细胞分泌的生长因子激活自体成纤维细胞的功能，并进一步增加细胞数量，达到修复皮肤的功效状态，具有自然性。最后，该方法规避了手术的失败风险，是一种非常安全的方法。另外，发明人发现，本发明公开的提高细胞活性的方法具有明显优于二者单独使用的优势——填充剂可以将间充质干细胞维持在一定的空间和体积范围内，不仅可以起到保护和润滑细胞的作用，还能够提高该范围内有效因子的作用浓度，更高效的促进目标细胞活性的增加。以透明质酸为例，其与间充质干细胞的联合使用除了有上述优势之外，透明质酸还可以起到保持间充质干细胞水分，保护间充质干细胞不受病原菌的侵害等作用。

根据本发明的另一具体实施例，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。脐带间充质干细胞来源广泛，它可采用从医疗废弃物——脐带中分离间充质干细胞，不需要从患者身上取材，免去患者手术的风险和痛苦，且脐带间充质干细胞免疫原性更低，更加安全，脐带间充质干细胞可进一步分泌包括SCF、bFGF、VEGF、IGF等在内的因子，刺激真皮层中成纤维细胞存活与增殖并进一步分泌胶原蛋白、透明质酸和弹性纤维，不仅如此脐带间充质干细胞还可以进一步促进血管化的发生，进一步起到营养真皮及皮下相关细胞的作用，药效更加有力。

根据本发明的具体示例，所述间充质干细胞为P1～P6代间充质干细胞。发明人通过实验发现，P6代以上的间充质干细胞的细胞状态不如早代次的细胞、分泌的细胞因子量也有所减少，P1～P6代间充质干细胞的细胞状态佳，细胞活性和因子分泌能力较强，用于提高细胞的活性的效果更加显著。

根据本发明的具体示例，所述间充质干细胞以悬浮于培养基、悬浮于生理盐水或贴壁培养于培养基中的形式提供的。发明人通过实验意外地发现，间充质干细胞以悬浮于培养基、悬浮于生理盐水或贴壁培养于培养基中的形式提供，可保证间充质干细胞良好的状态。

根据本发明的具体实施例，所述间充质干细胞以悬浮于培养基或悬浮于生理盐水中的形式提供，所述间充质干细胞的密度为0.1*10⁶-10*10⁶个/ml。有利于保持间充质干细胞的活性，有利于保持间充质干细胞较高的分泌生长因子以及胶原蛋白，进而使得本发明实施例的方法用于提高细胞活性的效果更加显著。

根据本发明的实施例，所述培养基或所述生理盐水与所述填充剂的体积比为1:0.5～1:5。发明人发现，间充质干细胞的在培养基或生理盐水中的悬浮密度为0.1*10⁶-10*10⁶个/ml，培养基或生理盐水与填充剂的体积比为1:0.5～1:5，既可以保证间充质干细胞良好的细胞状态，又可以保证填充剂有力的正向生理效应。培养基或生理盐水与填充剂的体积比为1:0.5～1:5，使得本发明实施例的用于提高细胞活性的方法的效果更佳。

根据本发明的一些具体实施例，所述间充质干细胞以贴壁培养于培养基中的形式提供，所述间充质干细胞在所述培养基中的密度为1*10⁴～3*10⁴个/cm²。发明人发现，细胞生长有密度依赖效应，过密或者过稀都会影响细胞状态，密度小于1*10⁴个/cm²时，细胞状态差；高于3*10⁴个/cm²时，细胞没有足够的空间生长，培养基的过度消耗，细胞状态差。根据本发明的具体实施例，间充质干细胞贴壁培养于培养基中，其贴壁密度为1*10⁴～3*10⁴个/cm²，有利于保持间充质干细胞的活性，有利于保持间充质干细胞较高的分泌生长因子以及胶原蛋白，进而使得本发明实施例的方法用于提高细胞活性的效果更加显著。

根据本发明的一些具体实施例，所述培养基与所述填充剂的体积比为1:0.5～1:5。发明人发现，培养基与填充剂的体积比在1:0.5～1:5范围内，所述方法在提高细胞的活性上效果更加显著。

根据本发明的实施例，所述目标细胞、所述间充质干细胞的个数比为1:0.1～1:10。发明人发现，目标细胞、间充质干细胞的个数比高于1:0.1，间充质干细胞的数量相对较少，其分泌的因子量低，不足以促进大量的目标细胞活性的增加；目标细胞、间充质干细胞的个数比低于1:10，目标细胞的数量过少，造成间充质干细胞分泌因子的饱和，在一定程度上造成一定的细胞和因子的浪费。目标细胞、所述间充质干细胞的个数比为1:0.1～1:10内，对提高目标细胞的活性更加快速、有效。

药物组合物

在本发明的另一方面，本发明提出了一种药物组合物，该药物组合物用于提高细胞活性，为用于创伤修复的新型药物组合物。根据本发明的实施例，该药物组合物包括：间充质干细胞；以及填充剂，其中，所述填充剂包括选自胶原蛋白、透明质酸、钙羟基磷灰石(微晶瓷)、聚乳酸和富血小板血浆的至少之一。利用根据本发明实施例的药物组合物提高细胞活性、创伤修复，相比于现有技术，克服了自体皮肤移植见效慢、效果不稳定的缺陷。根据本发明实施例的药物组合物采用间充质干细胞，免疫原性低；间充质干细胞和胶原蛋白、透明质酸、钙羟基磷灰石(微晶瓷)、聚乳酸、富血小板血浆复合使用，见效快；利用间充质干细胞分泌的生长因子激活自体成纤维细胞的功能，并进一步增加细胞数量，通过进一步促进血管化的形成，从而达到改善皮肤活性状态，具有自然性。此外，输注到皮肤缺损处的透明质酸或胶原蛋白本身具有一定的修复效果；最后，该药物组合物可采用涂抹、注射等方式，规避了手术的失败风险，是一种非常安全的药物。另外，发明人发现，本发明公开的药物组合物，填充剂可以将间充质干细胞维持在一定的空间和体积范围内，不仅可以起到保护和润滑细胞的作用，还能够提高该范围内有效因子的作用浓度，更高效的促进目标细胞活性的增加。以透明质酸为例，其与间充质干细胞的联合作为药物组合物使用，除了有上述优势之外，透明质酸还可以起到保持间充质干细胞水分，保护间充质干细胞不受病原菌的侵害等作用。

根据本发明的具体实施例，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。脐带间充质干细胞来源广泛，它可采用从医疗废弃物——脐带中分离间充质干细胞，不需要从患者身上取材，免去患者手术的风险和痛苦，且脐带间充质干细胞免疫原性更低，用药更加安全，脐带间充质干细胞则能够分泌胶原蛋白并进一步分泌包括SCF、bFGF、VEGF、IGF等在内的因子，刺激真皮层中成纤维细胞存活与增殖并进一步分泌胶原蛋白、透明质酸和弹性纤维，不仅如此脐带间充质干细胞还可以进一步促进血管化的发生，进一步起到营养真皮及皮下相关细胞的作用，药效更加有力。

根据本发明的具体示例，所述间充质干细胞为P1～P6代间充质干细胞。发明人发现，P6代以上的间充质干细胞的细胞状态不如早代次的细胞、分泌的细胞因子量也有所减少，使用P1～P6代间充质干细胞，所述药物组合物用于提高细胞活性效果更加显著。

根据本发明的具体示例，所述间充质干细胞以悬浮于培养基、悬浮于生理盐水或贴壁培养于培养基中的形式提供的。发明人通过实验发现，间充质干细胞以悬浮于生理盐水中、以悬浮于培养基或贴壁培养于培养基中形式供，可保持间充质干细胞的良好状态。

根据本发明的另一具体实施例，所述间充质干细胞以悬浮于培养基或悬浮于生理盐水中的形式提供，所述间充质干细胞的密度为0.1*10⁶-10*10⁶个/ml。间充干细胞以0.1*10⁶-10*10⁶个/ml的密度悬浮于培养基或悬浮于生理盐水中，有利于保持间充质干细胞的活性，有利于保持间充质干细胞分泌生长因子以及胶原蛋白，也可提供合适大小的体积比(细胞悬液体积：填充剂的体积)，进而使得本发明实施例的药物组合物用于提高细胞活性的效果更加显著。

根据本发明的另一具体实施例，所述间充质干细胞以贴壁培养于培养基中的形式提供，所述间充质干细胞的贴壁密度为1*10⁴～3*10⁴个/cm²。间充质干细胞以1*10⁴～3*10⁴个/cm²浓度贴壁培养培养于培养基中，有利于保持间充质干细胞的活性，有利于保持间充质干细胞较高的分泌生长因子以及胶原蛋白，进而使得本发明实施例的药物组合物用于提高细胞活性的效果更加显著。

根据本发明的一些具体实施例，所述培养基与所述填充剂的体积比为1:0.5～1:5。发明人发现，培养基与填充剂的体积比在1:0.5～1:5范围内，包括间充质干细胞与填充剂的药物组合物在提高细胞的活性上效果更加显著。

根据本发明的实施例，所述药物组合物的剂型为涂抹剂和注射剂。本发明的药物组合物可以通过任何常见的途径被给药，只要它可以到达预期的组织，主要通过涂抹、注射的途径给药。给药的各种方式是可以预期的，包括皮下，皮层，局部，但是本发明不限于这些已举例的给药方式。优选地，本发明的组合物以注射剂的剂型提供，本发明的药物组合物能够更加精准地抵达待治疗位点，药物组合物的治疗效果会更加有效、持久。此外，本发明的药物组合物可以使用将活性成分传送到靶细胞的特定器械来给药。

本发明的药物组合物的给药频率和剂量可以通过多个相关因素被确定，该因素包括要被处理的人的年龄，性别，体重和创伤等的严重程度以及作为活性成分的药物类型。根据本发明的一些实施例，剂量可分为适宜形式的1剂、2剂或多剂，以在整个时间段内以1次、2次或多次给药，只要达到创伤修复有效量即可。

术语“创伤修复有效量”是指药物组合物足以显著改善某些症状的量，也即为给定症状提供创伤修复效果的量。例如，在创伤修复中，减少、预防、延缓、抑制或阻滞任何症状的药物应当是创伤修复有效的。创伤修复有效量的药物不需要消除症状，但将为症状提供创伤修复，使得个体症状的发作被延缓、阻止或预防，或者症状得以缓解，或者症状的期限被改变。术语“创伤修复”用于指获得期望的药理学和/或生理学效果。所述效果就完全或部分预防症状而言可以是预防性的。本文使用的“创伤修复”涵盖哺乳动物、特别是人的症状。本文使用的“创伤修复”涵盖将药物给予个体以治愈、缓解、改善、减轻或抑制个体的症状的任何用药，包括但不限于将含本文所述药物组合物给予有需要的个体。

根据本发明的实施例，本发明的药物组合物可与常规创伤修复方法和/或疗法相结合使用，或者可与常规创伤修复方法和/或疗法分开使用。当本发明的药物组合物在采用与其它药物的联合疗法中给药时，它们可序贯地或同时地给予个体。或者，本发明的药物组合物可包含药学上可接受的载体或药学上可接受的赋形剂以及本领域已知的其它创伤修复药的组合。

药物组合物的用途

在本发明的再一方面，本发明提出了前面所述药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于创伤修复。本发明实施例的药物组合物中的间充质干细胞可以分泌包括SCF、bFGF、VEGF、IGF等在内的细胞因子，发挥营养、刺激真皮层中成纤维细胞存活与增殖，使得成纤维细胞进一步分泌胶原蛋白、透明质酸和弹性纤维，填补凹陷、修复创伤部位；另外间充质干细胞还可以促进血管化的形成，进一步起到营养的效果；不仅如此，间充质干细胞本身可以分泌产生胶原蛋白，进一步增加皮肤的厚度和弹性，使凹陷部分得到舒展，填平缺损，恢复皮肤的弹性和光泽。间充质干细胞进一步复合包括胶原蛋白、透明质酸、钙羟基磷灰石(微晶瓷)、聚乳酸和富血小板血浆的至少之一涂抹、注射到患者皮肤缺陷处可进行有效的修复创伤等。本发明实施例的药物用于修复创伤，具有见效快、药效持久、免疫原性低、自然性和风险低的优势。

需要说明的是，本申请所述的方法或药物组合物的应用包括但不限于“创伤修复”。”

需要说明的是，本申请中所述的“目标细胞与间充质干细胞以及填充剂进行接触”，既可以是细胞个体与填充剂之间的接触，也可以是间充质干细胞分泌的细胞因子与目标细胞及填充剂之间的接触。

需要说明的是，本申请中所述的“细胞活性”是指细胞的生理状态和功能，包括细胞基本状态、细胞增殖能力(有时称为活力)、分泌因子的能力以及常规细胞功能的维持。

需要说明的是，本申请所述的“细胞状态良好”是指细胞维持正常培养时的形态好(以间充质干细胞为例，细胞贴壁，细胞呈梭形，片状生长)，细胞透亮、边缘清楚，细胞折光性较好，整个细胞培养过程中无污染物(包括支原体、细菌、真菌、黑胶充、原虫等)出现。

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

在本实施例中，发明人筛选了包括不同来源的间充质干细胞与胶原蛋白或透明质酸或钙羟基磷灰石(微晶瓷)或聚乳酸或富血小板血浆的药物组合物对提高细胞活性的影响，在本实施例中，所待提高活性的细胞为成纤维细胞，不同来源的间充质干细胞包括：脐带血来源的、外周血来源的、脐带来源的、胎盘来源的、羊膜来源的、骨髓来源的、骨膜来源的、脂肪来源的、牙齿来源的等。发明人发现，脐带来源的间充质干细胞相比于其他来源的间充质干细胞，本身属于医疗废弃物，细胞免疫原性更低，具有一定的通用性，所获得的细胞质量高、数量多、纯度也较高。进而在后续实验中，发明人选择包括脐带来源的间充质干细胞与胶原蛋白或透明质酸或钙羟基磷灰石(微晶瓷)或聚乳酸或富血小板血浆的药物组合物进行后续检测。以下，以间充质干细胞与透明质酸的药物组合物为例，进行详细分析和描述。

实施例2

在本实施例中，发明人对所选用的脐带间充质干细胞的形态和表型进行了观察和鉴定。结果如下所述：

脐带间充质干细胞的形态表现为细胞贴壁，呈梭形，片状生长。具体形态如图1所示。脐带间充质干细胞在如图1的生长状态下，脐带间充质干细胞的增殖能力强，分泌包括bFGF、VEGF、IGF等在内的细胞因子以及胶原蛋白的增殖能力强，适于选择作为本发明药物组合物的脐带间充质干细胞。

发明人通过流式细胞检测鉴定所选择的脐带间充质干细胞表达CD90(阳性细胞率：99％)、CD105(阳性细胞率：99％)，CD73(阳性细胞率：99％)，不表达HLA-DR，CD14，CD19，CD34和CD45，结果如图2所示。

实施例3

在本实施例中，发明人对所选用的脐带来源的间充质干细胞与透明质酸的用量上进行了筛选。

发明人进行了间充质干细胞的细胞活率实验，实验过程如下所述：

1、消化脐带间充质干细胞：将一瓶生长至80％～90％的脐带间充质干细胞使用胰酶消化，培养基中和后，在1200rpm的条件下离心5min：

2、重悬细胞：离心后弃上清，使用脐带间充质干细胞培养基进行重悬：

3、接种细胞：将细胞按照同样的体积(100ul)进行接种(每孔2000个间充质干细胞)，每个孔重复5次，一共开展实验3天，即每个孔有15个重复样。之后将接种后的细胞于37℃，5％CO₂培养箱中过夜培养。

4、添加透明质酸/胶原蛋白：待细胞过夜培养贴壁后弃旧的培养基，并添加入新鲜的培养基。其中，对照组只添加培养基，实验组按照如下体积比添加透明质酸，其中培养基：透明质酸的体积比为：1：0.01，1：0.1，1：0.5，1：1，1：5，1：10，总体积为100ul。

5、检测：24小时、48小时和72小时后用枪头丢掉培养基和透明质酸/胶原蛋白，之后PBS洗一次，加入100ul新鲜的培养基，并加入10ul CCK8，轻柔混匀，避免气泡的产生，之后37℃，5％CO₂培养箱中静置3-4小时，之后于OD560处检测吸光光度值。全部时间点检测完毕后，进行统计数据的分析。

实验结果显示，培养基与透明质酸的体积比在1:0.5-1:5的范围内均可保持间充质干细胞的基本活性，间充质干细胞的活性佳。在体积比为1：0.01和1：0.1时，透明质酸过释，影响透明质酸的效果的发挥；体积比为1：10，则间充质干细胞的细胞状态变差，间充质干细胞死亡率明显上升。故优选培养基与透明质酸的体积比为1：0.5-1:5。

实施例4

在本实施例中，发明人利用所选用的脐带来源的间充质干细胞与透明质酸与成纤维细胞共培养，并对成纤维细胞的活性进行了检测。

实验过程如下所述：

1、消化成纤维细胞：将一瓶生长至80％～90％的成纤维细胞使用胰酶消化，培养基中和后，在1200rpm的条件下离心5min。

2、在消化成纤维细胞的同时，消化脐带间充质干细胞。具体操作如下所述：将一瓶生长至80％～90％的脐带间充质干细胞使用胰酶消化，培养基中和后，在1200rpm的条件下离心5min。

3、重悬细胞：离心后弃上清，使用培养基将细胞按照1*10⁵个/ml的密度进行重悬。

4、接种细胞：将1*10⁴个成纤维细胞接种到24孔板中，每个孔重复3次(一共有3个检测时间点，即每个孔有9个重复样)，之后放置孔径为1μm的Transwell小室(悬挂式细胞培养皿)并将0.7*10⁴个间充质干细胞接种于小室，培养基总体积为接近小室上沿为最佳，之后将接种后的细胞于37℃，5％CO₂培养箱中过夜培养。

5、添加透明质酸：待细胞过夜培养贴壁后弃旧的培养基，PBS洗1次后加入新鲜的无血清培养基。其中，对照组只添加培养基，实验组按照Transwell小室(悬挂式细胞培养皿)培养基体积与透明质酸体积比为1：1添加透明质酸。

6、检测：12小时、24小时和48小时后仅保留成纤维细胞并使用PBS洗一次，加入1ml新鲜的无血清培养基，并加入100ul CCK8，轻柔混匀，避免气泡的产生，之后37℃，5％CO₂培养箱中静置3-4小时，之后于OD560处检测吸光光度值。全部时间点检测完毕后，进行统计数据的分析。

实验结果显示，细胞培养12和24小时后有间充质干细胞以及填充剂所在的实验组，细胞状态和检测的OD值要明显优于单独使用无血清培养基组；48小时后，由于细胞长期处于无血清培养的状态下，整体状态均不如12小时和24小时，但是也可观察到实验组的结果优于对照组。上述实验结果证明，间充质干细胞以及填充剂可以提高目标细胞的活性，例如成纤维细胞。

实施例5

在本实施例中，发明人进一步通过动物实验验证了本发明实施例的药物组合物的用药效果。

将脐带间充质干细胞以1×10⁶/mL的密度(悬浮于生理盐水)与透明质酸按照1：2的比例在进行实验之前进行混合，混合均匀后形成细胞-透明质酸复合物。之后开展动物实验，具体操作为将对照组材料和脐带间充质干细胞-透明质酸复合物涂抹于雄性BLAB/c裸鼠(体量约20g，购自维通利华，生产许可证号：SCXK(京)2012-0001)创面处(前期处理形成)，每组老鼠各5只。具体结果如下：

(1)未开展实验之前的观察：包括对照组和实验组在内的准备开展动物实验的雄性BLAB/c裸鼠，其背部创面皮肤为全层皮肤缺损创面，整体为直径为1cm的接近圆形的创面区域。

(2)开展治疗：将对照组(透明质酸)和实验组(脐带间充质干细胞-透明质酸复合物)材料均匀涂抹于裸鼠背部创面区，然后以不粘纱布包扎创面，每日换药一次，10天后停止换药，术区加压包扎，外加腹带固定，防止位移。

(3)完成注射后的1、3、7、10天换药时观察创面的愈合情况并测定创面大小，结果提示，治疗后1天并无差异，3天开始出现差异并且随着时间的增加，差异更为明显。实验组的愈合情况较好，并且创面面积相对对照组而言有明显变小的趋势。

(4)完成治疗后3-4周的观察：实验开展3-4周后，再次观察动物创面形态。对照组有一定面积的创面发生愈合，实验组已基本愈合。同对照组相比，实验组的创伤愈合速度和愈合的面积明显优于对照组，这与同前期观察结果相一致。这表明脐带间充质干细胞-透明质酸复合物对皮肤创伤修复的效果更好。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。