一种细胞制剂及其制备方法和应用与流程

文档序号:11090901阅读:610来源:国知局
本发明涉及细胞制剂
技术领域
,特别涉及一种细胞制剂及其制备方法和应用。
背景技术
:心力衰竭(heartfailure)简称心衰,是指由于心脏的收缩功能和(或)舒张功能发生障碍,不能将静脉回心血量充分排出心脏,导致静脉系统血液淤积,动脉系统血液灌注不足,从而引起心脏循环障碍症候群,此种障碍症候群集中表现为肺淤血、腔静脉淤血。根据心力衰竭发生的缓急,临床可分为急性心力衰竭和慢性心力衰竭。急性心衰会引发急性肺水肿,起病急,病情可迅速发展至危重状态。突发的严重呼吸困难、端坐呼吸、喘息不止、烦躁不安并有恐惧感,呼吸频率可达30~50次/分;频繁咳嗽并咯出大量粉红色泡沫样痰;心率快,心尖部常可闻及奔马律;两肺满布湿啰音和哮鸣音。还会引发心源性休克,表现为低血压、组织低灌注状态、血流动力学障碍、代谢性酸中毒和低氧血症。急性心衰常危及生命,必须紧急抢救。目前的临床治疗主要采用药物治疗、介入治疗和外科治疗等手段:(1)初始治疗为经面罩或鼻导管吸氧;吗啡、袢利尿剂、强心剂等经静脉给予。使患者取坐位或半卧位,两腿下垂,减少下肢静脉回流。(2)病情仍不缓解者应根据收缩压和肺淤血状况选择应用血管活性药物,如正性肌力药、血管扩张药和血管收缩药等。(3)病情严重、血压持续降低(<90mmHg)甚至心源性休克者,应监测血流动力学,并采用主动脉内球囊反搏、机械通气支持、血液净化、心室机械辅助装置以及外科手术等各种非药物治疗方法。(4)动态测定BNP/NT-proBNP有助于指导急性心衰的治疗,治疗后其水平仍高居不下者,提示预后差,应加强治疗;治疗后其水平降低且降幅>30%,提示治疗有效,预后好。但这些治疗方法只能在一定程度上缓解心力衰竭的发生。干细胞是一类具有自我复制能力和分化能力的多潜能细胞,具有再生各种组织器官和人体的潜在功能,医学界将其称之为“万用细胞”。经过前人的研究发现,骨髓间充质干细胞在适宜的细胞因子作用下可以作为一种药物直接或者间接对受损的心肌细胞进行修复或者补充,目前已经成为心衰治疗的研究热点之一。因此,研发一种可有效治疗心衰的干细胞制剂成为必然趋势。技术实现要素:有鉴于此,本发明提供了一种细胞制剂及其制备方法和应用。该细胞制剂可有效治疗心衰。为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:本发明提供了一种细胞制剂,其包含间充质干细胞的富血小板血浆。富血小板血浆(Platelet-richplasma,PRP)指的是自体全血经离心后得到的血小板浓缩物,含有大量生长因子及蛋白质。血小板中含有大量的生长因子,如表皮生长因子(EGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、转化生长因子-β(TGF-β)、类胰岛素生长因子(IGF)、血管内皮生长因子(VEGF)等。由于其在组织再生方面发挥着十分重要的作用,近年来,它在临床尤其是口腔的创伤及缺损修复中被人们所重视,并取得了令人较为满意的效果。本发明将PRP与间充质干细胞联合使用后,能够更好地发挥间充质干细胞的修复作用,从而可显著提高左心室射血分数(LVEF)水平,并可显著降低利钠肽(BNP)水平,效果好于单独使用间充质干细胞或PRP,有效率可达80%~90%。可见,本发明细胞制剂可有效治疗心衰。作为优选,每mL富血小板血浆中含间充质干细胞(1~10)×106个。在本发明提供的实施例中,每mL富血小板血浆中含间充质干细胞1×106个。在本发明提供的另一实施例中,每mL富血小板血浆中含间充质干细胞5×106个。在本发明提供的另一实施例中,每mL富血小板血浆中含间充质干细胞1×107个。在本发明提供的实施例中,间充质干细胞为骨髓间充质干细胞。作为优选,骨髓间充质干细胞为P3代骨髓间充质干细胞。本发明还提供了该细胞制剂的制备方法,包括如下步骤:采用富血小板血浆重悬间充质干细胞,得到细胞制剂。在本发明中,间充质干细胞的制备方法为:取包含间充质干细胞的培养基,去除培养基,采用消化液进行消化,得到单细胞悬液;将单细胞悬液进行离心,洗涤,得到间充质干细胞。在本发明中,将外周血离心,获得富血小板血浆。在本发明提供的实施例中,富血小板血浆的制备方法具体为:将外周血采用300g转速离心5min,然后采用300g转速离心5min,最后采用800g转速离心5min。本发明还提供了该细胞制剂在制备提高LVEF水平或降低BNP水平药物中的应用。本发明还提供了该细胞制剂在制备治疗心衰药物中的应用。本发明还提供了一种药物,包括本发明提供的细胞制剂。该细胞制剂为包含间充质干细胞的富血小板血浆。在本发明提供的实施例中,药物还包括药学上可接受的辅料。本发明提供了一种细胞制剂及其制备方法和应用。该细胞制剂为包括间充质干细胞的富血小板血浆。本发明具有如下有益效果:本发明研究发现,将间充质干细胞和PRP联合使用后,可显著提高LVEF水平,并可显著降低BNP水平,效果好于单独使用间充质干细胞或PRP,有效率可达80%~90%。可见,本发明细胞制剂可有效治疗心衰。具体实施方式本发明公开了一种细胞制剂及其制备方法和应用,本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。本发明提供的细胞制剂及其制备方法和应用中所用生物材料均可由市场购得。下面结合实施例,进一步阐述本发明:实施例1:人骨髓间充质干细胞的制备从正规购买渠道获得骨髓10mL,肝素抗凝后Percoll(1.073×10-3g/L)密度梯度离心,取中间单核细胞层以低糖DMEM洗涤2次,接种入75cm2培养瓶,以含10%FBS的低糖DMEM培养。24h后换液,弃未贴壁的细胞,剩余的贴壁细胞是MSCs。每2~3天换液,待细胞生长至90%汇合后0.25%胰蛋白酶消化传代。实施例2:PRP的制备取患者外周血10mL,300g离心5min,然后再一次300g离心5min,最后800g离心5min,获得PRP。实施例3:细胞制剂的制备取实施例1制备的P3代骨髓间充质干细胞,吸去培养基,加入消化液进行消化,之后用适量血清终止消化,轻轻吹打成单细胞悬液。1500rpm,离心5min,弃上清,用4℃PBS洗涤细胞3次后重悬混匀,调整细胞浓度约为107个/mL。采用实施例2获得的PRP重悬P3代骨髓间充质干细胞,获得细胞制剂,其组成如下表所示。表1实施例3细胞制剂组成组分含量P3代骨髓间充质干细胞1×106个/mLPRP3.5mL实施例4:细胞制剂的制备取实施例1制备的P3代骨髓间充质干细胞,吸去培养基,加入消化液进行消化,之后用适量血清终止消化,轻轻吹打成单细胞悬液。1500rpm,离心5min,弃上清,用4℃PBS洗涤细胞3次后重悬混匀,调整细胞浓度约为107个/mL。采用实施例2获得的PRP重悬P3代骨髓间充质干细胞,获得细胞制剂,其组成如下表所示。表2实施例4细胞制剂组成组分含量P3代骨髓间充质干细胞5×106个/mLPRP3.5mL实施例5:细胞制剂的制备取实施例1制备的P3代骨髓间充质干细胞,吸去培养基,加入消化液进行消化,之后用适量血清终止消化,轻轻吹打成单细胞悬液。1500rpm,离心5min,弃上清,用4℃PBS洗涤细胞3次后重悬混匀,调整细胞浓度约为107个/mL。采用实施例2获得的PRP重悬P3代骨髓间充质干细胞,获得细胞制剂,其组成如下表所示。表3实施例5细胞制剂组成组分含量P3代骨髓间充质干细胞1×107个/mLPRP3.5mL实施例6:细胞制剂评价对实施例3-5制得的细胞制剂进行微生物检测和内毒素检测。其中,微生物检测(细菌、真菌)根据2015年版中华人民共和国药典第4部通则1100进行检测;内毒素检测根据2015年版中华人民共和国药典第4部通则1143进行检测。检测结果:实施例3-5制得的生物制剂在细菌、真菌和内毒素的检测中,均呈阴性,内毒素报告显示<0.25EU/mL。说明了该干细胞制剂的质量合格,可用于创口的修复。实施例7:制剂的修复效果检测试验方法:采用心肌内注射方式,对心衰造模成功的小鼠进行制剂注射。取60只心衰造模成功的小鼠,分为6组,包括阴性对照组、3组实验组、干细胞组和PRP组:阴性对照组:采用β受体阻滞剂常规治疗手段;实验组:分别用实施例3-5制得的制剂进行治疗;干细胞组:采用实施例1获得的干细胞进行治疗;PRP组:采用实施例2获得的PRP进行治疗。各组对小鼠的注射剂量如下:表4各组对小鼠的注射剂量组别小鼠数量(只)剂量阴性对照组28——实施例3281mL实施例4281mL实施例5281mL干细胞组282×107个PRP组282mL8周后观察小鼠的LVEF和BNP水平等指标,评判治疗的有效率。有效率计算方式为:LVEF和BNP指标显著改善的小鼠数量/28。结果如下表所示:表5小鼠的LVEF和BNP水平等指标注:*表示与对照组相比具有显著性差异,p<0.05。由上述试验结果可知,将间充质干细胞和PRP联合使用后,可显著提高LVEF水平,并可显著降低BNP水平,效果好于单独使用间充质干细胞或PRP,有效率可达80%~90%。可见,本发明细胞制剂可有效治疗心衰。以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本
技术领域
的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页1 2 3 
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