本发明属于干细胞
技术领域：
，具体涉及一种组合细胞制剂及其应用。
背景技术：
：糖尿病足是指由于糖尿病血管病变、神经病变及其感染等综合因素，导致神经性病变使得下肢保护功能减退，大血管和微血管病变使动脉灌注不足致微循环障碍而引起足部疼痛、皮肤深溃疡甚至肢体坏疽的疾病状态。糖尿病足是糖尿病一种严重的并发症，是糖尿病患者致残，甚至致死的重要原因之一，不但给患者造成痛苦，而且使其增添了巨大的经济负担。糖尿病足的主要治疗方法有干细胞移植治疗。干细胞移植治疗糖尿病足主要是根据干细胞可以在体内分化为血管内皮细胞和平滑肌细胞，分泌大量的促血管生成因子，形成新生血管的原理，将其移植到缺血下肢，使其逐渐分化并形成新生毛细血管，改善和恢复下肢血流，达到治疗下肢缺血的目的。干细胞移植作为治疗血管再生的新疗法，为糖尿病足患者带来了希望。目前糖尿病足用途的干细胞制剂主要为骨髓间充质干细胞制剂。该制剂的制备方法主要是：采集患者骨髓，分离单核细胞，将单个核细胞中的干细胞进行扩增，从而将扩增后的干细胞制备成骨髓来源的干细胞制剂。其缺点在于骨髓来源的干细胞量较少，扩增速度慢，从而限制了其应用。此外，采集骨髓还会给患者带来巨大的身体负担，进而可能加重病情。技术实现要素：有鉴于此，本发明的目的在于提供一种组合细胞制剂，用于制备治疗缺血性糖尿病足药物。本发明的具体技术方案如下：本发明提供了一种组合细胞制剂，包含：脐带间充质干细胞制剂和nkt细胞制剂。优选地，所述脐带间充质干细胞制剂中脐带间充质干细胞的细胞浓度为0.125×106～0.75×106个/ml。更优选地，所述脐带间充质干细胞为第三代至第六代脐带间充质干细胞。优选地，所述nkt细胞制剂中nkt细胞的细胞浓度为1.25×106～12.5×106个/ml。更优选地，所述诱导剂包括细胞生长因子il-2和il-15。更优选地，所述il-2的工作浓度为200～8000u/ml，更优选为500u/ml。更优选地，所述il-15的工作浓度为10～50ng/ml，更优选为30ng/ml。优选的，所述组合细胞制剂为注射制剂。更优选的，所述脐带间充质干细胞制剂的每次注射剂量为1×107～6×107个脐带间充质干细胞；所述nkt细胞制剂的每次注射剂量为1×108～10×108个nkt细胞。本发明还提供了上述组合细胞制剂在制备缺血性糖尿病足药物中的应用。综上所述，本发明提供了一种组合细胞制剂及其应用，所述组合细胞制剂为脐带间充质干细胞制剂和nkt细胞制剂。本发明脐带间充质干细胞以脐带作为组织来源，操作简单，而且脐带间充质干细胞扩增速度快，容易获得数量较多的干细胞；nkt细胞由外周血中的单个核细胞经过诱导培养获得，对提高机体免疫力有明显的作用，并能清除机体感染，促进糖尿病足患者的伤口愈合；这两种细胞制剂配伍使用，协同增效，可进一步改善和恢复糖尿病足患者的下肢血流，促进患者康复。具体实施方式下面将结合本发明具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例只是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本领域技术人员应当理解，对本发明的具体实施例进行修改或者对部分技术特征进行同等替换，而不脱离本发明技术方案的精神，均应涵盖在本发明保护的范围中。实施例1脐带间充质干细胞制剂的制备(1)在无菌条件下，取离开母体时间不超过2h的新鲜脐带，并筛查产妇是否携带传染性疾病病原体(乙肝表面抗原、丙肝抗体、梅毒抗体和艾滋病抗体阴性)，将新鲜脐带置于含有双抗的pbs于4℃保温箱中运回实验室；(2)将新鲜脐带用无菌的pbs清洗，75％乙醇消毒，然后再用pbs清洗；(3)将脐带剪碎成20mm3大小的块，并以0.5～1cm的间距均匀接种于培养皿中，缓慢加入dmem-f12完全培养基(购自gibco)，然后置于37℃，co2浓度为5％的培养箱中静止培养；其中，完全培养基的添加量为50～100μl/cm2；(4)待细胞贴壁融合后，使用胰酶进行消化、离心，分装至多个培养皿中进行传代培养；(5)待细胞生长融合度达80％以上，用胰酶消化，离心，继续传代培养；(6)收集第三代脐带间充质干细胞，用pbs缓冲液洗涤，离心，用注射级生理盐水重悬细胞，得到细胞终浓度为0.125×106～0.75×106个/ml的脐带间充质干细胞制剂。实施例2nkt细胞制剂的制备(1)采集40ml的外周血，将其与生理盐水按体积比1:1混匀，然后将混合溶液缓慢加入淋巴细胞分离液(axis-shield公司)中，其中混合溶液与淋巴细胞分离液的体积比为2:1；接着，700g离心20min；(2)离心后的离心管从上至下依次为单个核细胞层(pbmc)、淋巴细胞分离液层和红细胞层；收集单个核细胞层，采用生理盐水重悬、洗涤，500g离心10min，如此重复洗涤2次；(3)将单个核细胞用rpm1640基础培养基重悬，以1×106个/ml密度接种于培养瓶中，添加细胞生长因子il-2和il-15，然后置于37℃，浓度为5％的co2培养箱中培养；其中，il-2的终浓度为500u/ml，il-15的终浓度为30ng/ml；(4)诱导至第5天后，进行补液，全量补加细胞生长因子il-2和il-15，补液前细胞密度小于3×106个/ml，补液后细胞密度在0.5～1×106个/ml，此后，每隔3天补液和补加细胞生长因子；(5)至第14天后收集单个核细胞，500g离心10min，去上清，然后用注射级生理盐水重悬洗涤，再500g离心10min，重复洗涤一遍，接着用注射级生理盐水重悬细胞，得到细胞终浓度为1.25×106～12.5×106个/ml的nkt细胞制剂。对比例1骨髓间充质干细胞制剂的制备(1)采集骨髓组织20ml，将骨髓组织和dmem-f12培养基(购自gibco公司)按照1:3的体积比混匀，然后接种到15cm培养皿中，置于37℃、5％co2培养箱中培养72h；(2)72h后换液，除去未贴壁细胞，继续培养；(3)观察细胞形态，当细胞生长融合度达80％至90％时，进行传代培养；(4)传代至第三代骨髓间充质干细胞时，待细胞生长融合度达85％以上，用胰酶消化，并用pbs缓冲液洗涤，离心，用注射级生理盐水重悬细胞，得到细胞终浓度为0.125×106～0.75×106个/ml的骨髓间充质干细胞制剂。实施例3根据经典的wagner分级法，糖尿病足患者的损伤程度可以分为5级，包括0级：有发生足溃疡危险的足，皮肤无开放性病灶；1级：表面有溃疡，临床上无感染；2级：较深的溃疡感染病灶，常合并软组织炎，无脓肿或骨的感染；3级：深度感染，伴有骨组织病变或脓肿；4级：骨质缺损，部分趾、足坏疽；5级：足的大部或全部坏疽。纳入2级和3级糖尿病足患者各30名，随机分为3组，每组2级、3级糖尿病足患者各10名，依次为组合制剂组、对照组1和对照组2，按照以下方法进行治疗：组合制剂组：将实施例1的脐带间充质干细胞制剂和实施例2的nkt细胞制剂组合回输给20位缺血性糖尿病足患者，其中脐带间充质干细胞制剂的剂量为5×107个，nkt细胞制剂的剂量为5×108个；回输方法为第1天回输脐带间充质干细胞制剂，第2天回输nkt细胞制剂，以一个月为疗程，连续回输12个疗程，然后观察其疗效。对照组1：将实施例1的脐带间充质干细胞制剂回输给20位缺血性糖尿病足患者，其中脐带间充质干细胞制剂的剂量为5×107个，回输方法为第1天和第2天均回输脐带间充质干细胞制剂，以一个月为疗程，连续回输12个疗程，观察其疗效。对照组2：将对比例1的骨髓间充质干细胞制剂回输给20位缺血性糖尿病足患者，其中骨髓间充质干细胞制剂的剂量为5×107个，回输方法为第1天和第2天均回输骨髓间充质干细胞制剂，以一个月为疗程，连续回输12个疗程，观察其疗效。给予糖尿病足患者组合制剂组、对照组1和对照组2一年治疗后，60名患者按照wagner分级法评分如表1、表2所示，组合制剂组转化为0级的患者数明显高于对照组1和对照组2，无明显改善的患者数明显少于对照组1和对照组2，表明本发明组合细胞制剂能明显促进糖尿病足患者伤口的愈合。表1：不同制剂治疗2级糖尿病足患者后的转化情况组别无明显变化(例)转化为1级(例)转化为0级(例)组合制剂组136对照组1442对照组2433表2：不同制剂治疗3级糖尿病足患者后的转化情况实施例4分别抽取组合细胞制剂、实施例1、对比例1中的第3代脐带间充质干细胞和组合制剂中的外周血诱导培养的nkt细胞进行流式检测：(1)取1×106个第3代间充质干细胞，250g离心5min去上清，用含10％fbs的pbs溶液清洗2次；避光加入cd73、cd90、cd105、cd45、cd34、cd19、cd11b和hla-dr抗体各2.5μl室温孵育30min，用含10％fbs的pbs溶液清洗2次；用500mlrpmi1640培养基重悬细胞并过滤，上流式细胞仪进行检测，检测结果如表3所示。(2)取3×106个nkt细胞，250g离心5min去上清，用含10％fbs的pbs溶液清洗2次，避光加入cd3、cd4、cd8和cd56各2.5μl室温孵育30min，用含10％fbs的pbs溶液清洗2次，用500mlrpmi1640培养基重悬细胞并过滤，上流式细胞仪进行检测，检测结果如表4所示。流式检测结果显示脐带间充质干细胞表达cd105、cd73、cd90(表达量高于90％)，不表达cd45、cd34、cd19、cd11b和hla-dr(表达量低于2％)，显示间充质干细胞属性；nkt细胞表达cd3+cd56+(表达量高于20％)，检测结果如表2所示，显示nkt细胞属性。表3：间充质干细胞的流式检测结果表4：nkt细胞的流式检测结果标记抗体cd3+cd56+组合制剂56.7％当前第1页12