本发明涉及干细胞制剂技术领域，特别涉及一种干细胞制剂及其制备方法和应用。
背景技术：
关节软骨是一种黏弹性物质，不同活动部位表现不同的负荷-承载特性。关节软骨的这一重要特性及其减少关节表面摩擦的作用是软骨超微结构组成和化学构成的基本功能体现，关节软骨由稀疏的细胞排列而成，无血管、淋巴和神经供应。关节软骨在关节活动中起重要作用，其结构非常精细、科学，以适应不同的功能需要。创伤或运动损伤常导致关节软骨的急性损伤，引起关节疼痛、肿胀及功能障碍，严重影响患者的生活质量。软骨损伤后没有或很少有自我修复能力。因此软骨修复成为骨科领域重要问题。
微骨折手术，即在病变部位选择几个点，钻孔至软骨下骨，使缺损部位与软骨下骨髓相通，让具有分化潜能的骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)可以渗出进入缺损区，骨髓中的血和再生能力很强的干细胞混杂在一起覆盖在缺损的软骨表面进行软骨修复。软骨早期磨损可以进行软骨再生术。全层软骨和软骨下骨损伤有一定的修复能力，将部分软骨损伤钻孔至软骨下骨可诱导修复，修复组织起源于松质骨中具有成骨能力的间充质干细胞，修复组织为类透明软骨。但微骨折手术的方法需进行手术在病变部位打孔，病人承受很大的痛苦，并具有一定风险，而且骨髓中的MSCs量很少，生成修复性的纤维软骨组织所需的时间较长。
随着生物技术的发展，干细胞在治疗各种疾病模型中的研究愈来愈多，由于它具有自我更新并可分化成多种类型的细胞，有着广泛的应用前景，因此也被作为治疗关节软骨损伤的主要研究对象。但直接通过干细胞注射治疗关节软骨损伤存在细胞存活率偏低、细胞增殖困难的缺点。因此，急需提供一种可有效治疗关节软骨损伤的药物制剂。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明提供了一种干细胞制剂及其制备方法和应用。该干细胞制剂中干细胞增殖活性好，可有效治疗关节软骨损伤。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种干细胞制剂，包括脂肪间充质干细胞、富血小板血浆及透明质酸水溶液。
脂肪间充质干细胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)是近年来从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的间充质干细胞。研究发现ADSCs细胞能够在体外稳定增殖且衰亡率低，同时它具有取材容易、少量组织即可获取大量干细胞，适宜大规模培养，对机体损伤小等优点，而且其来源广泛，体内储备量大，适宜自体移植，逐渐成为近年来新的研究热点之一。
富血小板血浆(PRP)是指利用自身的血液，提取出的富含高浓度血小板和各种自身生长因子的血浆。PRP在促创面愈合、激活组织原位干细胞活性起到积极的效果，经PRP预处理的MSCs移植到机体后存活率提高，且其促血管新生等生物作用增强。
透明质酸是关节滑液的主要成分，可以保护关节软骨，防止或延缓进一步退变，清除致痛物质，有明显减轻疼痛的作用，可用于治疗关节炎和加速伤口愈合。
本发明将脂肪间充质干细胞与PRP、透明质酸或其盐组合使用后，对关节软骨损伤具有很好的修复作用，效果显著好于微骨折手术，且脂肪间充质干细胞取材方便、增殖活性好、纯度高、能在短时间内得到数量较多的MSCs，该干细胞制剂可减轻病人的治疗痛苦及风险，加强了疗效，缩短了治疗时间。
作为优选，该干细胞制剂中各组分的用量为：
脂肪间充质干细胞： (1～10)×106个；
富血小板血浆： 1～10mL；
透明质酸水溶液： 1～10mL。
在本发明提供的实施例中，干细胞制剂中各组分的用量为：
脂肪间充质干细胞： (1～3)×106个；
富血小板血浆： 2mL；
透明质酸水溶液： 2mL。
作为优选，透明质酸水溶液的质量百分浓度为0.0008～0.0012g/mL。
在本发明中，透明质酸也可以为透明质酸盐，如透明质酸钠，同样能够实现本发明。在本发明提供的实施例中，透明质酸盐为透明质酸钠。
在本发明提供的实施例中，脂肪间充质干细胞为第2代脂肪间充质干细胞。
在本发明提供的实施例中，干细胞制剂的剂型为注射剂。
本发明还提供了该干细胞制剂在制备软骨修复药物中的应用。
在本发明提供的实施例中，软骨为关节软骨。
本发明还提供了该干细胞制剂的制备方法，包括：采用PRP重悬脂肪间充质干细胞，然后与透明质酸水溶液混匀，得到所述干细胞制剂。
在本发明提供的实施例中，脂肪间充质干细胞的制备方法为：将脂肪组织用生理盐水冲洗，去除残留的血细胞和组织碎片。向组织中加入等体积的0.1％Ⅰ型胶原酶，放入37℃气浴振荡器中消化30min。然后以1500r/min，离心10min后弃掉上层脂肪组织及下层悬液得到ADSCs。将其重悬，密度调整到1×105/mL，然后接种在培养面积为25cm2的细胞培养瓶中。当ADSCs融合度达80％左右，收集细胞使用、传代或冻存。
在本发明提供的实施例中，富血小板血浆的制备方法为：静脉抽取全血；第一次离心，1600r/min，离心10min，血液将被分层血浆和红细胞2层，丢弃红细胞层；第二次离心，5000r/min，离心5min，离心后吸弃部分血浆，用余下的制剂最终体积的二分之一体积的血浆重悬沉淀，制备成PRP。
本发明提供了一种干细胞制剂及其制备方法和应用。该干细胞制剂包括脂肪间充质干细胞、富血小板血浆及透明质酸水溶液。本发明至少具有如下优势之一：
1、本发明将脂肪间充质干细胞与PRP、透明质酸或其盐组合使用后，对关节软骨损伤具有很好的修复作用，效果显著好于微骨折手术；
2、脂肪间充质干细胞取材方便：抽脂手术操作简单，痛楚少，只需抽取少量脂肪组织就能培养出大量的脂肪干细胞，且只抽取一次脂肪，就可以分多次制备制剂；脂肪间充质干细胞增殖活性好、纯度高、能在短时间内得到数量较多的MSCs，生成修复性的纤维软骨组织的疗效更好；
3、本发明干细胞制剂使用操作简单，可减轻病人的治疗痛苦及风险，加强疗效，缩短治疗时间。
附图说明
图1示P2代脂肪间充质干细胞的形态，其中，1-1示P2代细胞放大40倍的形态，1-2示P2代细胞放大100倍的形态。
具体实施方式
本发明公开了一种干细胞制剂及其制备方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供了一种干细胞制剂，其制备方法包括：
1)ADSCs培养
将吸脂来源的脂肪组织用生理盐水冲洗，去除残留的血细胞和组织碎片。向组织中加入等体积的0.1％Ⅰ型胶原酶，放入37℃气浴振荡器中消化30min。然后以1500r/min，离心10min后弃掉上层脂肪组织及下层悬液得到ADSCs。将其重悬，密度调整到1×105/mL，然后接种在培养面积为25cm2的细胞培养瓶中。当ADSCs融合度达80％左右，收集细胞使用、传代或冻存。
2)制备PRP
清洁消毒后，静脉抽取全血10～20ml。第一次离心，1600r/min，离心10min，血液将被分层血浆和红细胞2层，丢弃红细胞层；第二次离心，5000r/min，离心5min，离心后吸弃部分血浆，用余下的制剂最终体积的二分之一体积的血浆重悬沉淀，制备成PRP。
3)取1)中培养好的ADSCs(1～3)×106个，用2)制备好的2ml PRP重悬干细胞。
4)取透明质酸钠溶液，与含干细胞的PRP等体积混匀，制备成最终成品制剂，制剂中透明质酸钠溶液与PRP体积比为1:1，干细胞不占体积。
5)向关节腔内注射制剂。
本发明提供的干细胞制剂及其制备方法和应用中所用试验动物、试剂或仪器均可由市场购得。在本发明提供的实施例中，透明质酸钠溶液的质量百分浓度为0.001g/mL。完全培养基为含有10％FBS的DMEM-F12培养基。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
(1)ADSCs培养
提前2-3周，将吸脂来源的兔脂肪组织约10ml用生理盐水冲洗，去除残留的血细胞和组织碎片。向组织中加入等体积的0.1％Ⅰ型胶原酶，放入37℃气浴振荡器中消化30min。然后以1500r/min，离心10min后弃掉上层脂肪组织及下层悬液得到ADSCs。将其重悬，密度调整到1×105/mL，然后接种在培养面积为25cm2的细胞培养瓶中。待细胞生长至汇合度达80％，用PBS洗2遍后，往细胞中加入0.015ml/cm2的0.25％的胰酶+0.04％EDTA消化2min，用10倍于消化液的完全培养基终止酶解，取样计数，200g离心5min，去上清，根据计数结果，用完全培养基重悬细胞沉淀至细胞密度为5×104cell/mL，接种培养。当ADSCs融合度达80％左右，收集细胞使用、传代或冻存。P2代ADSCs细胞形态图片见图1。
由图1可见，倒置显微镜下观察传代细胞，增殖能力较强，生长速度较快，形态、大小均一，呈放射状至梭形整齐排列生长。冻存前，细胞折光性强，呈长梭形，无杂细胞，背景清晰，细胞纯度较高。
(2)制备PRP
清洁消毒后，静脉抽取全血20ml。第一次离心，1600r/min，离心10min，血液将被分层血浆和红细胞2层，丢弃红细胞层；第二次离心，5000r/min，离心5min，离心后吸弃部分血浆，用余下的2ml左右血浆重悬沉淀，制备成PRP。
(3)干细胞制剂的制备
取(1)中培养好的P2代ADSCs细胞1×106个，用2mL PRP重悬ADSCs。
取2mL透明质酸钠溶液，与含ADSCs的PRP等体积混匀，制备成最终成品制剂。
(4)功效鉴定
1)建立兔子软骨损伤模型
无菌环境下将兔的后腿膝关节内侧纵行全层切开，全长2cm，直达关节腔，手摇钻在股骨髁间前侧钻一直径厚度达软骨全层的圆形孔洞，造成全层膝关节软骨损伤动物模型，切口间断全层缝合四五针。术后各实验动物均肌注庆大霉素4×104U/d至术后第3天以预防可能出现的术后感染。实验动物均放回笼子正常饲养，不予制动措施。随机取9只兔子分为3组，每组3只。
2)试验分组
对比例1组：采用关节镜，在软骨损伤部位的软骨下板打孔制造微骨折，当看到骨髓血从孔中散发出来时，说明打孔深度已达到要求。取2ml透明质酸钠溶液与2ml PRP充分混匀后，注射到已进行微骨折手术的兔子的关节腔内。(微骨折手术+PRP+透明质酸钠)
对比例2组：取2ml透明质酸钠溶液与2ml PRP充分混匀后，注射到兔子的关节腔内。(PRP+透明质酸钠)
对比例3组：取P2代ADSCs细胞1×106个，用4mL PRP重悬ADSCs。
对比例4组：取P2代ADSCs细胞1×106个，用4mL透明质酸钠溶液重悬ADSCs。
实施例1组：将本实施例1制备成的最终成品制剂注射到兔子的关节腔内。(ADSCs+PRP+透明质酸钠)
3)试验结果
动物一般状况观察：9只兔子术后均能正常活动、进食及饮水，未出现膝关节红肿、流脓等感染表现，未出现其他疾病情况。
软骨修复大体形态观察结果：术后3个月，分别处死各组实验兔，对膝关节软骨进行大体形态观察。具体如下：
实施例1软骨损伤区域不明显，全部由软骨样组织覆盖，新生组织与周围正常软骨组织无明显界限，表面光滑；
对比例1关节软骨损伤区域较明显，边缘增生，形态规则，中央部不平整，可见新生组织覆盖，覆盖组织呈白色，与损伤边缘边界不清，软骨退变较严重。
对比例2软骨损伤区域明显，边缘无增生，形态极不规则，裂隙明显，未见或极少见新生组织覆盖，软骨退变严重。
对比例3关节软骨损伤区域不太明显，可见新生组织覆盖，覆盖组织呈白色，与损伤边缘边界模糊。
对比例4关节软骨损伤区域不太明显，可见新生组织覆盖，覆盖组织呈白色，与损伤边缘边界模糊。
实施例2
(1)ADSCs培养
提前2-3周，将吸脂来源的兔脂肪组织约10ml用生理盐水冲洗，去除残留的血细胞和组织碎片。向组织中加入等体积的0.1％Ⅰ型胶原酶，放入37℃气浴振荡器中消化30min。然后以1500r/min，离心10min后弃掉上层脂肪组织及下层悬液得到ADSCs。将其重悬，密度调整到1×105/mL，然后接种在培养面积为25cm2的细胞培养瓶中。待细胞生长至汇合度达80％，用PBS洗2遍后，往细胞中加入0.015ml/cm2的0.25％的胰酶+0.04％EDTA消化2min，用10倍于消化液的完全培养基终止酶解，取样计数，200g离心5min，去上清，根据计数结果，用完全培养基重悬细胞沉淀至细胞密度为5×104cell/mL，接种培养。当ADSCs融合度达80％左右，收集细胞使用、传代或冻存。
(2)制备PRP
清洁消毒后，静脉抽取全血20ml。第一次离心，1600r/min，离心10min，血液将被分层血浆和红细胞2层，丢弃红细胞层；第二次离心，5000r/min，离心5min，离心后吸弃部分血浆，用余下的2ml左右血浆重悬沉淀，制备成PRP。
(3)干细胞制剂的制备
取(1)中培养好的P2代ADSCs细胞2×106个，用2mL PRP重悬ADSCs。
取2mL透明质酸钠溶液，与含ADSCs的PRP等体积混匀，制备成最终成品制剂。
(4)功效鉴定
1)建立兔子软骨损伤模型
无菌环境下将兔的右侧后腿膝关节内侧纵行全层切开，全长2cm，直达关节腔，手摇钻在股骨髁间前侧钻一直径厚度达软骨全层的圆形孔洞，造成全层膝关节软骨损伤动物模型，切口间断全层缝合四五针。术后各实验动物均肌注庆大霉素4×104U/d至术后第3天以预防可能出现的术后感染。实验动物均放回笼子正常饲养，不予制动措施。随机取3只兔子。
2)试验结果
动物一般状况观察：兔子术后均能正常活动、进食及饮水，未出现膝关节红肿、流脓等感染表现，未出现其他疾病情况。
软骨修复大体形态观察结果：术后3个月，处死实验兔，对膝关节软骨进行大体形态观察。实施例2软骨损伤区域不明显，全部由软骨样组织覆盖，新生组织与周围正常软骨组织无明显界限，表面光滑，与实施例1效果对比没有明显差异。
实施例3
(1)ADSCs培养
提前2-3周，将吸脂来源的兔脂肪组织约10ml用生理盐水冲洗，去除残留的血细胞和组织碎片。向组织中加入等体积的0.1％Ⅰ型胶原酶，放入37℃气浴振荡器中消化30min。然后以1500r/min，离心10min后弃掉上层脂肪组织及下层悬液得到ADSCs。将其重悬，密度调整到1×105/mL，然后接种在培养面积为25cm2的细胞培养瓶中。待细胞生长至汇合度达80％，用PBS洗2遍后，往细胞中加入0.015ml/cm2的0.25％的胰酶+0.04％EDTA消化2min，用10倍于消化液的完全培养基终止酶解，取样计数，200g离心5min，去上清，根据计数结果，用完全培养基重悬细胞沉淀至细胞密度为5×104cell/mL，接种培养。当ADSCs融合度达80％左右，收集细胞使用、传代或冻存。
(2)制备PRP
清洁消毒后，静脉抽取全血20ml。第一次离心，1600r/min，离心10min，血液将被分层血浆和红细胞2层，丢弃红细胞层；第二次离心，5000r/min，离心5min，离心后吸弃部分血浆，用余下的2ml左右血浆重悬沉淀，制备成PRP。
(3)干细胞制剂的制备
取(1)中培养好的P2代ADSCs细胞3×106个，用2mL PRP重悬ADSCs。
取2mL透明质酸钠溶液，与含ADSCs的PRP等体积混匀，制备成最终成品制剂。
(4)功效鉴定
1)建立兔子软骨损伤模型
无菌环境下将兔的右侧后腿膝关节内侧纵行全层切开，全长2cm，直达关节腔，手摇钻在股骨髁间前侧钻一直径厚度达软骨全层的圆形孔洞，造成全层膝关节软骨损伤动物模型，切口间断全层缝合四五针。术后各实验动物均肌注庆大霉素4×104U/d至术后第3天以预防可能出现的术后感染。实验动物均放回笼子正常饲养，不予制动措施。随机取3只兔子。
2)试验结果
动物一般状况观察：兔子术后均能正常活动、进食及饮水，未出现膝关节红肿、流脓等感染表现，未出现其他疾病情况。
软骨修复大体形态观察结果：术后3个月，处死实验兔，对膝关节软骨进行大体形态观察。实施例3软骨损伤区域不明显，全部由软骨样组织覆盖，新生组织与周围正常软骨组织无明显界限，表面光滑，与实施例1效果对比没有明显差异。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。