一种由四神丸制备的含药血清及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物药物领域，具体涉及一种由四神丸制备的含药血清及其制备方法和在治疗结肠癌上的应用。

背景技术：

由于全球经济的高速发展，城市化、工业化、人口老龄化进程不断加快，环境污染逐渐加重，生活方式不断改变(尤其是饮食)，导致恶性肿瘤的发病率和死亡率不断升高，并呈持续上升趋势。结肠癌(cancer of colon)是消化系统最常见的恶性肿瘤，与饮食的关系最为密切，是我国九大常见恶性肿瘤之一。结肠癌的首选治疗方式仍然是尽早进行外科手术切除，但是由于每个人身体状况和病情不一样，一般手术后复发和转移的几率是很大的，而且手术价格昂贵。而中医治疗向来是寻求达到治本的目的，且费用相对较低，因此寻求合适的中药进行开发、研究，成为国内外学者坚定不移的研究方向。已有学者在研发中药治疗疾病的进程上取得了不小的成就，例如：2015年10月，药学家屠呦呦女士因发现青蒿素治疗疟疾的新疗法而获得诺贝尔科学奖。因此新的植物型药物的开发和研制有不可小觑的潜力。

中药作为一类天然药物，已经在中国沿袭了几千年。中药具有多靶点的特点，这与肿瘤是由于多环节突变而非单一原因而发生的、多级的、多途径的和多病灶的特点是相吻合的，因此中药在结肠癌的预防及治疗中更有优势。本发明中用到的四神丸就是典型的中药方剂。四神丸初次发现于宋代陈文忠著作的《陈氏小儿病源痘诊方论》一书中，其由《普济本事方》中记载的二神丸(即肉豆藉、补骨脂组成)和五味子散(即五味子、吴茱萸组方)两剂药方组成。两剂药方并用相辅相成，温补脾肾，对固肠止泻等症状药用效果极佳。随着时代的发展，该方己经超出了原有方剂的应用范围，临床中也以其作为基础方广泛应用于各科室，并取得了良好的疗效。我们现今用的四神丸是由补骨脂、吴茱萸、肉豆蔻、五味子、生姜和红枣六位药材组成的，是治疗脾肾虚寒型结肠炎的中药方剂，对过敏性结肠炎、慢性结肠炎、溃疡性结肠炎等症均有良好疗效，且已证实其能够较佳地消除结肠炎相关的各种症状和有效修复、保护病人的肠粘膜。中药的给药方式主要有：口服给药、灌肠给药以及二者联合用药。因此运用中药预防与治疗癌症是中医药发展的必然趋势。

中药血清药理学的相关研究在近年来中药或中药复方研究中有了新的进展，它主要是通过模拟中药或中药复方在体内的消化、吸收、转化、代谢的一些过程，然后通过采集服用(或注射)中药的动物的血液并分离血清，进行体外培养实验研究的一种新的方法。中药服用或注射的方法及简称如下：静脉注射(iv)、腹腔注射(ip)、口服(po)、皮下注射(ih)、灌胃(ig)、肌注(im)、静滴(iv)等。这种实验方法的提出，既可以在一定程度上排除中药或中药复方直接进行体外实验产生的难以确定的因素干扰，也可以使实验结果的可信度大大提高，更重要的是中药血清使疗效更加显著。芦冲等研究发现，半枝莲醇提物灌胃大鼠后获得的含药血清对HT-29人结肠癌细胞有抑制作用，作用机制可能不仅与抑制细胞生长有关，还与阻滞细胞生长周期及诱导细胞凋亡有关。范钦等研究发现，九香虫灌胃后处理得到的含药血清孵育SW480人结肠癌细胞，可促使结肠癌细胞凋亡，并影响凋亡相关因子P53、FADD的表达，从而达到抗肿瘤作用。肖海娟等研究发现，肠胃清含药血清能够逆转HCT116人结肠癌铂类化疗耐药，其机制与促进肿瘤细胞DNA损伤、诱导凋亡有关。李素云等研究发现，扶正抑癌方含药血清通过上调上皮钙黏蛋白表达和下调神经钙黏蛋白的表达，抑制LoVo人结肠癌细胞的间叶表型细胞即发生上皮间质化转变，从而降低lovo细胞的侵袭力和运动能力。目前常用的结肠癌细胞系有HCT116，HCT8，HT-29，LS174T，LoVo，SW480，SW620等。但暂未发现使用由四神丸含制备的药血清对LS174T结肠癌细胞做相关研究的报道。

技术实现要素：

发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种由四神丸制备的含药血清；该含药血清可有效抑制结肠癌细胞的增殖、促进其凋亡、抑制其转移。

本发明还提供一种由四神丸制备的含药血清的制备方法及其应用。

技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述的一种由四神丸制备的含药血清，所述含药血清为将四神丸对大鼠进行灌胃后，采血得到。

其中，所述四神丸由肉豆蔻、补骨脂、五味子、吴茱萸和大枣组成，经磨粉、煮沸、煎煮后，将提取液过滤并且蒸馏浓缩得到膏体，再经冷冻干燥后粉碎得到。

所述所大鼠为清洁级SD雄性大鼠，大鼠购自扬州大学比较医学中心，体重为250～400g。

本发明所述的由川芎醇提物制备的含药血清的制备方法，包括如下步骤：

(1)给大鼠按体重比灌胃四神丸(20-40)g/kg；

(2)末次灌胃后1-2h对大鼠进行麻醉，无菌条件下经腹主动脉采血；

(3)将血液静置3-5h，离心，取上清，灭活后过滤除菌，得到含药血清，分装，冻存备用。

5、根据权利要求1所述的含药血清，其特征在于，步骤(1)所述灌胃每日1-2次，持续4-6d，末次禁食12-14h给药。

作为优选，步骤(3)所述离心为3000-5000rpm，4-6℃离心10-15min。

作为优选，步骤(3)所述灭活为56-60℃灭活25-30min。

作为优选，步骤(3)所述过滤除菌为通过滤膜过滤除菌，优选为0.22um的滤膜。

本发明所述的由四神丸制备的含药血清在制备治疗结肠癌的药物中应用。

进一步地，所述由四神丸制备的含药血清在制备治疗LS174T结肠癌细胞的药物中应用。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：

1、本发明由四神丸制备的含药血清根据四神丸温补脾肾，固肠止泻的特征，可有效抑制结肠癌细胞的增殖、促进其凋亡、抑制其转移。

2、本发明以LS174T结肠癌细胞作为模型，使用四神丸灌胃大鼠后处理得到的含药血清培养LS174T结肠癌细胞，对于抑制结肠癌细胞的增殖、促进其凋亡、抑制其转移的效果明显要优于四神丸以及现有治疗结肠癌的药物；其中给大鼠按体重比灌胃四神丸(20-40)g/kg制备的含药血清，取浓度为10％(与DMEM培养基体积比)的含药血清抑制LS174T结肠癌细胞存活率可以达到43.45％以下，促进LS174T结肠癌细胞存活率凋亡率达到33.54％以上；而四神丸和现有治疗结肠癌的药物抑制细胞存活率最好的效果仅为87.32％、74.72％，四神丸和现有治疗结肠癌的药物促进凋亡率最好的效果为15.45％、15.28％；同时该含药血清可以有效的抑制LS174T结肠癌细胞的迁移能力，从而验证其具有抑制结肠癌的良好效果；该四神丸制备的含药血清制备的药物在治疗结肠癌时也具有显著的效果。

3、本发明的制备方法安全可控，并且便于操作、保管、贮存和运输。

附图说明

图1为实施例4给大鼠按体重比灌胃四神丸40g/kg制备的含药血清以及对照组孵育LS174T结肠癌细胞，Transwell细胞迁移检测细胞迁移能力的示意图；

图2为实施例5给大鼠按体重比灌胃四神丸30g/kg制备的含药血清以及对照组孵育LS174T结肠癌细胞，Transwell细胞迁移检测细胞迁移能力的示意图；

图3为实施例5给大鼠按体重比灌胃四神丸20g/kg制备的含药血清以及对照组孵育LS174T结肠癌细胞，Transwell细胞迁移检测细胞迁移能力的示意图。

具体实施方式

以下结合实施例和附图对本发明作进一步说明。

实施例1

由四神丸制备的含药血清

(1)首先称取肉豆蔻(煨)200g、补骨脂(盐炒)400g、五味子(醋制)200g、吴茱萸(制)100g、大枣(去核)200g，全部购买于北京同仁堂天然药物(唐山)有限公司，经磨粉、煎煮、提取后合并提取液，将提取液通过200目筛网过滤并且蒸馏浓缩得到膏体，再经冷冻干燥后粉碎得到四神丸。

(2)给400g清洁级SD雄性大鼠按体重比灌胃四神丸40g/kg，每日1次，持续4d，末次禁食12h给药；

(2)末次灌胃后1h对大鼠用戊巴比妥钠麻醉进行麻醉，无菌条件下经腹主动脉采血；

(3)将血液静置3h，3000rpm，4℃离心15min，取上清，56℃灭活30min后通过0.22μm滤膜过滤除菌，得含药血清，分装，冻存于－80℃冰箱备用。

实施例2

由四神丸制备的含药血清

(1)首先称取肉豆蔻(煨)200g、补骨脂(盐炒)400g、五味子(醋制)200g、吴茱萸(制)100g、大枣(去核)200g，全部购买于北京同仁堂天然药物(唐山)有限公司，经磨粉、煎煮、提取后合并提取液，将提取液通过200目筛网过滤并且蒸馏浓缩得到膏体，再经冷冻干燥后粉碎得到四神丸。

(2)给300g清洁级SD雄性大鼠按体重比灌胃四神丸30g/kg，每日2次，持续6d，末次禁食14h给药；

(2)末次灌胃后2h对大鼠用戊巴比妥钠麻醉进行麻醉，无菌条件下经腹主动脉采血；

(3)将血液静置5h，5000rpm，6℃离心10min，取上清，60℃灭活25min后通过0.22μm滤膜过滤除菌，得含药血清分装，冻存于－80℃冰箱备用。

实施例3

由四神丸制备的含药血清

(1)首先称取肉豆蔻(煨)200g、补骨脂(盐炒)400g、五味子(醋制)200g、吴茱萸(制)100g、大枣(去核)200g，全部购买于北京同仁堂天然药物(唐山)有限公司，经磨粉、煎煮、提取后合并提取液，将提取液通过200目筛网过滤并且蒸馏浓缩得到膏体，再经冷冻干燥后粉碎得到四神丸。

(2)给250g清洁级SD雄性大鼠按体重比灌胃四神丸20g/kg，每日2次，持续5d，末次禁食12h给药；

(2)末次灌胃后2h对大鼠用戊巴比妥钠麻醉进行麻醉，无菌条件下经腹主动脉采血；

(3)将血液静置3h，5000rpm，4℃离心10min，取上清，60℃灭活25min后通过0.22μm滤膜过滤除菌，得含药血清，分装，冻存于－80℃冰箱备用。

实施例4

将实施例3给大鼠按体重比灌胃四神丸40g/kg后处理得到的含药血清孵育LS174T结肠癌细胞。

将LS174T结肠癌细胞解冻复苏后加入含有(体积比)10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基制成细胞悬液，分种于培养瓶中并置于5％CO₂(细胞培养的常规环境，CO₂体积分数为5％)，饱和湿度95％，37℃培养箱中培养。正常培养时约每天更换1次培养液，等到细胞生长融合度达到70％-80％时进行传代培养；传代培养时首先弃去培养瓶中的旧培养液，加入37℃磷酸缓冲盐溶液(PBS)液洗瓶2次，在25cm²培养瓶中加入2mL浓度为0.25％的胰蛋白酶(即2.5g/L的胰蛋白酶溶液)进行消化。然后在倒置显微镜下仔细随时观察，当发现细胞质回缩、细胞间隙变大时终止消化。接下来弃去胰酶溶液，加入含(体积比)10％胎牛血清的DMEM培养基之后用吸管轻柔吹打使贴壁细胞悬浮。紧接着将含悬浮细胞的培养液转移至10mL离心管中，1500rpm离心5min，弃上清液。将细胞重新悬浮于5mL含(体积比)10％胎牛血清的完全培养基中。细胞计数结束，选择合适浓度将细胞分装到新的无菌培养瓶进行培养。最后6h后可见细胞贴壁，以后每2-3天换液次，待细胞长滿瓶底70％-80％后再次消化传代。

取4-6代的生长良好，融合度约为60％-70％的细胞进行细胞实验。呈亚融合状态的细胞，轻柔吹打配成单细胞悬液并接种于96孔培养板，24孔培养板以及Tranwell铺板，细胞贴壁生长24h后用各个分组对细胞进行孵育24h处理，具体分组情况如下：

对照组(共设6组，组1-组6)：

1、空白对照组：用无血清DMEM培养液孵育细胞24h；

2、胎牛血清对照组：DMEM培养液中仅加入血清(所述血清为标准胎牛血清，购自杭州四季青生物科技有限公司)，血清浓度(体积比)为10％，该DMEM培养液孵育细胞24h；

3、空白血清对照组：DMEM培养液中仅加入血清(血清采集方法与实施例1相同，不同在于没有灌胃)，血清浓度(体积比)为10％，该DMEM培养液孵育细胞24h；

4、四神丸对照组：用四神丸与没有灌胃的大鼠得到的血清进行混合(血清采集方法与实施例1相同，不同在于没有灌胃，四神丸与实施例1的大鼠体重的重量比为40g/kg)，然后加入到DMEM培养液中，血清浓度(体积比)为10％，用该DMEM培养液孵育细胞24h；

5、生理盐水对照组：给大鼠按体重比灌胃生理盐水40g/kg得到的血清(血清采集方法与实施例1相同，不同之处四神丸换成生理盐水)加入到DMEM培养液中加入，血清浓度(体积比)为10％，用该DMEM培养液孵育细胞24h；

6、现有药物对照组：用现有治疗结肠癌药物5-Fu(5-氟尿嘧啶)与没有灌胃的大鼠得到的血清进行混合(血清采集方法与实施例1相同，不同在于没有灌胃，5-Fu与实施例1的大鼠体重的重量比为40g/kg，5-Fu购买于上海旭东海普药业有限公司)，然后加入到DMEM培养液中，血清浓度(体积比)为10％，用该DMEM培养液孵育细胞24h；

对照组中没有设置5-氟尿嘧啶灌胃制备含药血清对照组及5-氟尿嘧啶注射制备含药血清对照组是由于5-氟尿嘧啶注射是其常用方法，不适合灌胃使用，而在本实施例中注射就失去其本身对照组的意义。

处理组(共设2组，组7和组8)：

按实施例1给大鼠按体重比灌胃四神丸40g/kg制得的含药血清加入到DMEM培养液中，配制出含药血清浓度(体积比)为10％和15％两种DMEM培养液，分别用浓度10％和15％含药血清DMEM培养液孵育细胞24h。

实施例5

将实施例2给大鼠按体重比灌胃四神丸30g/kg后处理得到的含药血清孵育LS174T结肠癌细胞，具体的细胞培养方法与实施例4相同；

对照组(共设6组，组1-组6)：

1、空白对照组：用无血清DMEM培养液孵育细胞24h；

2、胎牛血清对照组：DMEM培养液中仅加入血清(所述血清为标准胎牛血清，购自杭州四季青生物科技有限公司)，血清浓度(体积比)为10％，该DMEM培养液孵育细胞24h；

3、空白血清对照组：DMEM培养液中仅加入血清(血清采集方法与实施例2相同，不同在于没有灌胃)，血清浓度(体积比)为10％，该DMEM培养液孵育细胞24h；

4、四神丸对照组：用四神丸与没有灌胃的大鼠得到的血清进行混合(血清采集方法与实施例2相同，不同在于没有灌胃，四神丸与实施例2大鼠体重的重量比为30g/kg)，然后加入到DMEM培养液中，血清浓度(体积比)为10％，用该DMEM培养液孵育细胞24h；

5、生理盐水对照组：给大鼠按体重比灌胃生理盐水30g/kg得到的血清(血清采集方法与实施例2相同，不同之处四神丸换成生理盐水)加入到DMEM培养液中加入，血清浓度(体积比)为10％，用该DMEM培养液孵育细胞24h；

6、现有药物对照组：用现有治疗结肠癌药物5-Fu(5-氟尿嘧啶)与没有灌胃的大鼠得到的血清进行混合(血清采集方法与实施例2相同，不同在于没有灌胃，5-Fu与实施例2大鼠体重的重量比为30g/kg)，然后加入到DMEM培养液中，血清与DMEM培养液重量比为10％，用该DMEM培养液孵育细胞24h；

处理组(共设2组，组7和组8)：

按实施例2给大鼠按体重比灌胃四神丸30g/kg制得的含药血清加入到DMEM培养液中，配制出含药血清浓度(体积比)为10％和15％两种DMEM培养液，分别用浓度10％和15％含药血清DMEM培养液孵育细胞24h。

实施例6

将实施例3给大鼠按体重比灌胃生理盐水20g/kg后处理得到的含药血清孵育LS174T结肠癌细胞，具体的细胞培养方法与实施例4相同；

对照组(共设4组)：

对照组(共设6组，组1-组6)：

1、空白对照组：用无血清DMEM培养液孵育细胞24h；

2、胎牛血清对照组：DMEM培养液中仅加入血清(所述血清为标准胎牛血清，购自杭州四季青生物科技有限公司)，血清浓度(体积比)为10％，该DMEM培养液孵育细胞24h；

3、空白血清对照组：DMEM培养液中仅加入血清(血清采集方法与实施例2相同，不同在于没有灌胃)，血清浓度(体积比)为10％，该DMEM培养液孵育细胞24h；

4、四神丸对照组：用四神丸与没有灌胃的大鼠得到的血清进行混合(血清采集方法与实施例3相同，不同在于没有灌胃，四神丸与实施例3大鼠体重的重量比为20g/kg)，然后加入到DMEM培养液中，血清浓度(体积比)为10％，用该DMEM培养液孵育细胞24h；

5、生理盐水对照组：给大鼠按体重比灌胃生理盐水20g/kg得到的血清(血清采集方法与实施例3相同，不同之处四神丸换成生理盐水)加入到DMEM培养液中加入，血清浓度(体积比)为10％，用该DMEM培养液孵育细胞24h；

6、现有药物对照组：用现有治疗结肠癌药物5-Fu(5-氟尿嘧啶)与没有灌胃的大鼠得到的血清进行混合(血清采集方法与实施例3相同，不同在于没有灌胃，5-Fu与实施例3大鼠体重的重量比为20g/kg)，然后加入到DMEM培养液中，血清与DMEM培养液重量比为10％，用该DMEM培养液孵育细胞24h；

处理组(共设2组，组7和组8)：

按实施例3给大鼠按体重比灌胃四神丸20g/kg制得的含药血清加入到DMEM培养液中，配制出含药血清浓度(体积比)为10％和15％两种DMEM培养液，分别用浓度10％和15％含药血清DMEM培养液孵育细胞24h。

试验例1MTT方法检测药物对LS174T结肠癌细胞增殖活性的作用

MTT全称3-(4，5-Dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，是一种黄色的染料。处于增殖期的活细胞细胞线粒体中含有的琥珀脱氢酶可使外源性的MTT还原成难溶的针状Formazan结晶，呈蓝紫色，并沉淀在活细胞中，细胞活力与Formazan的形成量成正比，DMSO能使Formazan结晶溶解，使用酶标仪于波长570nm处测定吸收值，以此间接反映细胞增殖的情况。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

分别取实施例4，5，6各分组孵育后制备的96孔板的细胞，每孔定量加100μL含(体积比)15％胎牛血清(FBS)完全培养基；然后置于5％CO₂，饱和湿度95％，37℃培养箱中进行培养24～72h；培养终止前4h加入10μL/孔(浓度为5mg/mL)的MTT；继续培养4h后，小心吸弃上清培养液后加100μL/孔二甲基亚砜(DMSO)终止反应，于振荡器上震荡10min左右，使结晶物充分溶解；酶标仪570nm检测OD值，实验至少重复三次。记录结果，计算存活率。

细胞存活率(％)＝处理组平均OD值/对照组平均OD值×100％。

结果如1至3所示。

表1 40g/kg的四神丸灌胃大鼠时MTT法检测LS174T结肠癌细胞存活率

*表示与对照组比较差异显著

表2 30g/kg的四神丸灌胃大鼠时MTT法检测LS174T结肠癌细胞存活率

*表示与对照组比较差异显著

表3 20g/kg的四神丸灌胃大鼠时MTT法检测LS174T结肠癌细胞存活率

*表示与对照组比较差异显著

由表1至3可知，给大鼠按体重比分别灌胃四神丸40、30、20g/kg制备得到的含药血清，当使用重量比10％和15％的含药血清时LS174T结肠癌细胞存活率可以达到43.45％和43.03％以下，与四神丸对照组的细胞存活率以及现有药物对照组的细胞存活率相比具有明显的优势，都具有很好的抑制LS174T结肠癌细胞存活效果，说明本发明实施例制备的含药血清具有良好的抑制LS174T结肠癌细胞的存活的作用。

由表2可知，给大鼠按体重比灌胃四神丸30g/kg制得的含药血清效果最好，10％和15％含药血清组的细胞存活率分别是40.63％，40.58％；15％含药血清组时细胞存活率为40.58％，与10％含药血清组无统计学差异，因此，通过给大鼠按体重比灌胃四神丸30g/kg制得的含药血清，使用其10％的含药血清就可以取得良好的抑制LS174T结肠癌细胞存活效果。

试验例2流式细胞术检测细胞凋亡

磷脂酞丝氨酸(PS)只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸由脂膜内侧翻向外侧。在鞘液的约束和包围下，待测样本的细胞排成单列由流动室喷嘴高速喷出，而形成细胞液柱。液柱在通过检测区时，在入射激光束的照射下可产生侧向散射光(SSC)和前向散射光(FSC)，它们分别反映细胞颗粒度和大小，根据这些特性将细胞分类。样本经一种或几种特殊荧光标记后，可在激光束的激发下产生特定荧光，该特定荧光可被光学系统检测并分析，由此得到相应的各种细胞特性。AnnexinV是一种分子量35～36kDa的Ca²⁺依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。将AnnexinV进行FITC标记，以标记了AnnexinV作为荧光探针，利用流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。

分别取实施例4，5，6各分组孵育后制备的24孔板的细胞，弃去培养上清后每孔加入0.5mL浓度为0.25％的胰蛋白酶(即2.5g/L的胰蛋白酶溶液)，在倒置显微镜下观察待细胞开始变圆，加少量含血清培养液，终止消化，吹打悬浮细胞后移至离心管中，1000rpm下离心10min，弃上清，用预冷的PBS洗涤2次，用250μL结合缓冲液重悬细胞。调节其浓度为1×10⁶/mL，取100μL细胞悬液于5mL流式管中，加入5μL AnnexinVFITC和10μL 20μg/mL的PI溶液，混匀后室温避光孵育15min，在反应管中加入400μL PBS，上流式细胞仪分析。实验结果经计算机软件ModFitLT3.0分析软件分析细胞周期细胞数，每组实验至少重复3次；结果见表4-6所示。

表格40g/kg的四神丸灌胃大鼠时LS174T结肠癌细胞凋亡率的变化

*表示与对照组比较差异显著

表5 30g/kg的四神丸灌胃大鼠时LS174T结肠癌细胞凋亡率的变化

*表示与对照组比较差异显著

表6 20g/kg的四神丸灌胃大鼠时LS174T结肠癌细胞凋亡率的变化

*表示与对照组比较差异显著

由表1-3可知，给大鼠按体重比分别灌胃四神丸40、30、20g/kg制备得到的含药血清，当使用重量比10％和15％的含药血清时LS174T结肠癌细胞存活率可以达到33.54％和33.47％以上，与四神丸对照组的细胞存活率以及现有药物对照组的细胞存活率相比具有明显的优势，都可以使LS174T结肠癌细胞的凋亡率大大增加，说明本发明实施例制备的含药血清具有良好的促进LS174T结肠癌细胞的凋亡的作用。

由表2可知，给大鼠按体重比灌胃四神丸30g/kg制得的含药血清效果最好，10％和15％含药血清组的细胞凋亡率分别是35.71％，35.38％；15％含药血清组时细胞存活率为35.38％，与10％含药血清组无统计学差异，因此，通过给大鼠按体重比灌胃四神丸30g/kg制得的含药血清，使用其10％的含药血清就可以取得良好的促使LS174T结肠癌细胞凋亡效果。

试验例3Transwell侵袭实验检测四神丸含药血清对细胞侵袭能力的影响

细胞迁移实验是将Transwell小室放入培养板中，小室内称为上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的肿瘤细胞种在上室内，下室加入含FBS或某些特定的趋化因子的培养液，由于聚碳酸酯膜具有通透性，肿瘤细胞会向营养成分高的下室迁移，计数进入下室的细胞数量就能反应细胞的迁移能力。

分别取实施例4，5，6的经过各个分组孵育的Transwell铺板细胞，细胞的终浓度大小约为5×10⁵个/mL；24孔板的下室内加入500μL的含(体积比)20％FBS的DMEM，在Transwell小室内加入100μL的细胞悬液，常规培养24h；细胞培养完成后，轻提Transwell小室，倾倒室内的培养基，用适量的PBS将细胞洗涤2遍，之后每孔加入1mL 4％的多聚甲醛(4％的多聚甲醛为4g多聚甲醛融于100mLPBS中制得；PBS缓冲液的配制：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄ 1.44g，KH₂PO₄ 0.24，加入800mL去离子水，充分搅拌，用HCl调节pH值至7.4，补充去离子水定容至1000mL，高压蒸汽灭菌，保存于4℃。)固定细胞15min，PBS再清洗3次，每次5min，再使用0.1％的结晶紫染色细胞30min，用PBS洗涤3次，每次5min，使用超纯水轻轻冲洗湿润小室表面的细胞，最后用湿润棉签轻轻擦去未迁移过膜的细胞，风机风干；倒置Transwell小室，显微镜进行观察和拍照。于显微镜下随机选取5个视野观察细胞，并计数迁移细胞数。

图1为实施例1给大鼠按体重比灌胃四神丸40g/kg制备的含药血清孵育LS174T结肠癌细胞，Transwell细胞迁移检测细胞迁移能力，具体分组参照实施例4，其中1空白对照组；2胎牛血清对照组；3空白血清对照组；4四神丸对照组；5生理盐水对照组；6现有药物对照组；7浓度(体积比)10％含药血清组；8浓度(体积比)15％含药血清组。图中＊为P<0.05，差异显著。

图2为实施例2给大鼠按体重比灌胃四神丸30g/kg制备的含药血清孵育LS174T结肠癌细胞，Transwell细胞迁移检测细胞迁移能力，具体分组参照实施例5，其中1空白对照组；2胎牛血清对照组；3空白血清对照组；4四神丸对照组；5生理盐水对照组；6现有药物对照组；7浓度(体积比)10％含药血清组；8浓度(体积比)15％含药血清组。图中＊为P<0.05，差异显著。

图3为实施例3给大鼠按体重比灌胃四神丸20g/kg制备的含药血清孵育LS174T结肠癌细胞，Transwell细胞迁移检测细胞迁移能力，具体分组参照实施例6，其中1空白对照组；2胎牛血清对照组；3空白血清对照组；4四神丸对照组；5生理盐水对照组；6现有药物对照组；7浓度(体积比)10％含药血清组；8浓度(体积比)15％含药血清组。图中＊为P<0.05，差异显著。

从图1至3可以看出，给大鼠按体重比分别灌胃四神丸40g/kg、30g/kg和20g/kg后经腹主动脉取血离心后，将其配制成与DMEM培养液体积比10％、15％的含药血清对LS174T结肠癌细胞进行孵育，结果表明含药血清孵育的LS174T结肠癌细胞相对于4四神丸对照组、6现有药物对照组迁移能力显著降低，说明本发明实施例制备的含药血清具有良好的抑制LS174T结肠癌细胞迁移的作用。