本发明涉及免疫治疗领域，具体地，本发明提供了一种免疫治疗制剂。
背景技术：
免疫治疗immunotherapy包括免疫细胞的治疗和药物的治疗，免疫细胞的治疗是指把病人的细胞从血里面分离出来，在体外用一些细胞因子，使它变成一种杀伤细胞，再回输到血液中去，这种杀伤细胞可以识别肿瘤细胞进行杀伤。肿瘤细胞免疫疗法全称肿瘤细胞生物基因免疫疗法，其作用不是杀死全部癌症细胞,而是当癌症细胞负荷明显降低时，机体的免疫功能恢复后，通过清除微小的残留病灶或明显抑制了残留癌症细胞增殖的方式来达到治疗癌症的目的。癌症免疫治疗正是通过人为的干预，来调动机体自身的免疫系统对癌细胞进行杀灭和抑制其增殖。
目前，免疫治疗的基本流程通常是用单采机或者普通采一定分量患者自身血液，在GMP实验室里手工Ficoll分离单个核细胞置于培养瓶中，加入培养液和细胞因子刺激细胞活化增殖。经过细胞培养后，回输DC、CIK细胞，经过多个疗程的治疗从而杀除患者体内肿瘤细胞。然而，上述流程存在一些缺陷，例如：(1)手工Ficoll分离血液里的单核细胞，因为依靠人员，所以技术稳定性低，细胞的质量和数量完全依赖技术人员的素质；(2)手工Ficoll方法是开放式操作，容易导致细胞污染；(3)手工Ficoll方法时间比较长，需要平均3小时15分，是工业化的主要瓶颈；(4)自动化仪器主要功能是自动分离血液里的单核细胞后直接进行免疫细胞定向培养扩增后进行肿瘤免疫治疗，并没有用于单核细胞保存用途。
除此之外，现有的免疫治疗是通过采集病人的血液，分离免疫细胞后定向扩增后回输给病人。然而，病人的免疫细胞本身杀灭肿瘤的能力便有缺陷，这导致免疫治疗的效果不甚理想。
综上所述，本领域迫切需要一种疗效好，适合标准化生产，且质量稳定可控的免疫治疗制剂。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种疗效好，适合标准化生产，且质量稳定可控的免疫治疗制剂。
本发明的第一方面，提供了一种免疫治疗制剂的制备方法，所述方法包括步骤：
(i)提供一对象的自体血液样本；
(ii)对部分所述的血液样本进行离心，取上层血浆，与培养基混合，制备成细胞冻存液；
(iii)对剩余的所述血液样本进行血细胞分离，得到细胞样本；
(iv)将所述的细胞样本注入一个或多个容器中，在所述容器中加入步骤(ii)所得到的细胞冻存液，得到所述的免疫治疗制剂。
在另一优选例中，所述的自体血液样本为健康人的血液样本。
在另一优选例中，所述的自体血液样本是从健康人体内采集的，且在所述采集前，对采集对象进行选自下组的一项或多项检查：采血标准检测、肿瘤指标检查、淋巴细胞亚群检测。
在另一优选例中，所述的自体血液样本的含量为150ml。
在另一优选例中，所述的步骤(iii)中，所述的血细胞分离用Sepax 2血细胞分离机进行。
在另一优选例中，所述的步骤(ii)中，所述的上层血浆是通过以下方法制备的：将血液样本加到离心管中，在室温(优选为10-40℃，更优选为20℃)下，2500-3500rpm离心5-15min，吸取上层血浆。
在另一优选例中，所述的对象是治疗对象或采样对象。
在另一优选例中，所述方法还包括步骤：对所述的免疫治疗制剂进行冻存保存。
在另一优选例中，所述的方法还包括步骤：冻存保存后，对所述的免疫治疗制剂进行复苏。
在另一优选例中，所述的复苏通过梯度平衡法进行。
在另一优选例中，所述的梯度平衡法包括：将所述的免疫治疗制剂放入温 水(优选为35-40℃)后取出，在所述试剂内滴加一定量配制的细胞复苏培养液，并且平衡25-35s后，重复滴加步骤和平衡步骤直至细胞悬液样本体积和复苏培养液体积的比例为1:4。
在另一优选例中，所述的自体血液样本为150ml。
本发明的第二方面，提供了一种冻存血细胞分离物制剂，所述的免疫治疗制剂包括以下的组分：分离的血细胞，和冻存液；
其中，所述的分离的血细胞是从健康人体血液样本中分离得到的；
所述的冻存液含有：70-90％(v/v)人血浆，5-15％(v/v)DMSO，以及5-15％(v/v)羟乙基淀粉；
且所述的人血浆与所述的分离的血细胞是从同一血液样本中提取。
在另一优选例中，所述的人血浆是通过以下方法制备的：将血液样本加到离心管中，在室温(优选为10-40℃，更优选为20℃)下，2500-3500rpm离心5-15min，吸取上层血浆。
在另一优选例中，在所述的制剂中，所述的分离的血细胞的浓度为2-10×105个细胞/ml。
在另一优选例中，所述的冻存血细胞分离物制剂包括：单核细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、血小板，或其组合。
在另一优选例中，所述的冻存血细胞分离物制剂包括：造血干细胞、间充质干细胞、T淋巴细胞、NK细胞、T负责性淋巴细胞、T记忆淋巴细胞，或其组合。
在另一优选例中，所述的冻存血细胞分离物制剂包括：0.5-2％造血干细胞、0.25-1％间充质干细胞、40-80％T淋巴细胞，10-25％NK细胞，20-45％T负责性淋巴细胞，10-30％T记忆淋巴细胞，或其组合。
在另一优选例中，所述的冻存液含有：75-85％(v/v)人血浆，7.5-12.5％(v/v)DMSO，以及7.5-12.5％(v/v)羟乙基淀粉。
在另一优选例中，所述的冻存液含有：78-82％(v/v)人血浆，9-11％(v/v)DMSO，以及9-11％(v/v)羟乙基淀粉。
本发明的第三方面，提供了一种冻存血细胞分离物试剂组合，所述的试剂组合含有：
(a)第一细胞冻存物，所述的第一细胞冻存物含有10-20ml如本发明第二方面所述的冻存组合物；
(b)第二细胞冻存物，所述的第二细胞冻存物包括0.5-2ml如本发明第二方面 所述的冻存组合物；
(c)任选的第三至第n细胞冻存物，所述的第三至第n细胞冻存物包括0.5-2ml如本发明第二方面所述的冻存组合物，其中，3≤n≤20。
本发明的第四方面，提供了一种如本发明第二方面所述的免疫治疗制剂的复苏方法，所述方法包括步骤：
(1)提供一复苏培养液，所述的复苏培养液包括：15-30％(v/v)FBS、70-85％(v/v)无血清培养液；
(2)将所述的免疫治疗制剂放入温水(优选为35-40℃)，待制剂融化后取出；
(3)在所述试剂内滴加一定量配制的细胞复苏培养液，并且平衡25-35s；
(4)重复上述步骤(3)，直至细胞悬液样本体积和复苏培养液体积的比例为1:3-5。
在另一优选例中，所述的复苏培养液为细胞复苏当天配制的。
在另一优选例中，上述步骤(3)重复8次，且所述细胞复苏培养液按照以下量进行添加(总添加体积为X)：
第一次添加：1/40*X；
第二次添加：1/40*X；
第三次添加：3/40*X；
第四次添加：1/8*X；
第五次添加：1/8*X；
第六次添加：1/8*X；
第七次添加：1/4*X；
第八次添加：1/4*X。
本发明的第五方面，提供了一种免疫治疗注射制剂，所述制剂包括：(1)如本发明第二方面所述的制剂或如本发明第三方面所述的制剂组合中的血细胞，或用如本发明第四方面所述的方法复苏得到的血细胞；以及(2)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的药学上可接受的载体为生理盐水。
本发明的第六方面，提供了一种如本发明第五方面所述的注射制剂的制备方法，所述方法包括步骤：
用如本发明第四方面所述的方法对如本发明第二方面所述的制剂或如本发明第三方面所述的制剂组合进行血细胞复苏培养，得到第一细胞复苏培养 物；
用生理盐水对所述的第一细胞复苏培养物进行洗涤，得到第二细胞复苏培养物；
用生理盐水悬浮所述的第二细胞复苏培养物，得到所述的注射制剂。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了细胞的冻存复苏培养增殖情况示意图。
具体实施方式
本发明人经过长期而深入的研究，设计了一种制备用于肿瘤的免疫治疗的制剂的方法。所述的制备方法得到的制剂性质稳定，能够长时间保存，冻存后易于复苏且能够保持良好的抗肿瘤效果。且所述的方法能够在治疗对象未患肿瘤时即预先制成制剂，从而取得更佳的治疗效果。基于上述发现，发明人完成了本发明。除非特别说明，本文中，各个百分比为质量百分比或体积百分比。
免疫治疗制剂的制备
本发明提供了一种免疫治疗制剂的制备方法，所述的制备方法包括步骤：
(i)提供一治疗对象的自体血液样本；其中，所述的自体血液样本为健康人的血液样本，是从健康人体内采集的，且在所述采集前，对采集对象进行本领域常规的健康检查，例如选自下组的一项或多项检查：采血标准检测、肿瘤指标检查、淋巴细胞亚群检测。
所述的血液样本的量没有特别的限制，在本发明的一个优选实施例中，所述的自体血液样本为150ml。
(ii)对部分所述的血液样本进行离心，取上层血浆，与培养基混合，制备成细胞冻存液；其中，所述的上层血浆优选是通过以下方法制备的：将血液样本加到离心管中，在室温(优选为10-40℃，更优选为20℃)下，2500-3500rpm离心 5-15min，吸取上层血浆。
(iii)对剩余的所述血液样本进行血细胞分离，得到细胞样本；所述的分离优选为自动分离，更优选地，所述的血细胞分离用Sepax 2血细胞分离机进行。
(iv)将所述的细胞样本注入一个或多个容器中，在所述容器中加入步骤(ii)所得到的细胞冻存液，得到所述的免疫治疗制剂。
所述的免疫治疗制剂制备后，进行冻存保存，留待需要时使用。例如，在对象健康时采集血液，制备成上述的免疫治疗制剂，然后对所述的免疫治疗制剂进行冻存保存。待对象有治疗需要(如罹患肿瘤)时，对所述的免疫治疗制剂进行复苏并回输入人体，从而起到治疗效果。
在本发明的优选实施例中，所述的复苏通过梯度平衡法进行。优选地，所述的梯度平衡法包括：将所述的免疫治疗制剂放入温水(优选为35-40℃)后取出，在所述试剂内滴加一定量配制的细胞复苏培养液，并且平衡25-35s后，重复滴加步骤和平衡步骤直至细胞悬液样本体积和复苏培养液体积的比例为1:4。
免疫治疗制剂
本发明还提供了一种免疫治疗制剂(或冻存血细胞分离物制剂)，所述的免疫治疗制剂包括以下的组分：分离的血细胞，和冻存液；
其中，所述的分离的血细胞是从健康人体血液样本中分离得到的；
所述的冻存液含有：70-90％(v/v)人血浆，5-15％(v/v)DMSO，以及5-15％(v/v)羟乙基淀粉；
且所述的人血浆与所述的分离的血细胞是从同一血液样本中提取。
在另一优选例中，所述的人血浆是通过以下方法制备的：将血液样本加到离心管中，在室温(优选为10-40℃，更优选为20℃)下，2500-3500rpm离心5-15min，吸取上层血浆。
在另一优选例中，在所述的制剂中，所述的分离的血细胞的浓度为2-10×105个细胞/ml。
在另一优选例中，所述的冻存血细胞分离物制剂包括：单核细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、血小板，或其组合。
在另一优选例中，所述的冻存血细胞分离物制剂包括：造血干细胞、间充质干细胞、T淋巴细胞、NK细胞、T负责性淋巴细胞、T记忆淋巴细胞，或其组合。
在另一优选例中，所述的冻存血细胞分离物制剂包括：0.5-2％造血干细胞、0.25-1％间充质干细胞、40-80％T淋巴细胞，10-25％NK细胞，20-45％T负责性淋巴细胞，10-30％T记忆淋巴细胞，或其组合。
在另一优选例中，所述的冻存液含有：75-85％(v/v)人血浆，7.5-12.5％(v/v)DMSO，以及7.5-12.5％(v/v)羟乙基淀粉。
在另一优选例中，所述的冻存液含有：78-82％(v/v)人血浆，9-11％(v/v)DMSO，以及9-11％(v/v)羟乙基淀粉。
本发明的免疫治疗制剂优选地还可以制成制剂组合的形式。在本发明的一个优选实施例中，所述的制剂组合含有：
(a)第一细胞冻存物，所述的第一细胞冻存物包括10-20ml如本发明第二方面所述的冻存组合物；
(b)第二细胞冻存物，所述的第二细胞冻存物包括0.5-2ml如本发明第二方面所述的冻存组合物；
(c)任选的第三至第n细胞冻存物，所述的第三至第n细胞冻存物包括0.5-2ml如本发明第二方面所述的冻存组合物，其中，3≤n≤20。
制成上述的制剂组合的情况下，在使用过程中，可以先对第一细胞冻存物进行复苏并回输给治疗对象，若有需要，可以再将第二细胞冻存物或任选的第三至第n细胞冻存物中的一个或多个进行复苏，然后回输给治疗对象。复苏的细胞总量可以根据具体需要进行实际调节。
免疫治疗制剂的复苏
本发明还提供了一种如前文中所述的免疫治疗制剂的复苏方法，所述方法包括步骤：
(1)提供一复苏培养液，所述的复苏培养液包括：15-30％(v/v)FBS、70-85％(v/v)无血清培养液；
(2)将所述的免疫治疗制剂放入温水(优选为35-40℃)，待制剂融化后取出；
(3)在所述试剂内滴加一定量配制的细胞复苏培养液，并且平衡25-35s；
(4)重复上述步骤(3)，直至细胞悬液样本体积和复苏培养液体积的比例为1:3-5。
在另一优选例中，所述的复苏培养液为细胞复苏当天配制的。
在本发明的优选实施例中，上述步骤(3)重复8次，且所述细胞复苏培养液 按照以下量进行添加(总添加体积为X)：
第一次添加：1/40*X；
第二次添加：1/40*X；
第三次添加：3/40*X；
第四次添加：1/8*X；
第五次添加：1/8*X；
第六次添加：1/8*X；
第七次添加：1/4*X；
第八次添加：1/4*X。
在复苏完成后，用生理盐水对所述的细胞进行清洗，除去冻存液，培养液后，用生理盐水配制为悬浮液，然后用于注射。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
与现有技术相比，本发明的主要优点包括：
(1)自动化健康人单核细胞分离后进行单核细胞保存建立细胞库，解决手工Ficoll分离依靠人员，技术稳定性低，细胞的质量和数量完全依赖技术人员的素质，同时自动分离的健康人单核细胞可以进行长期保存，因为健康人的免疫细胞保持拥有抗肿瘤能力，通过采血后自动化分离单核细胞后保存下来，到将来发现患病后复苏健康的单核细胞进行定向免疫细胞培养治病，提高免疫治疗的效果。
(2)自动化代替开放式手工Ficoll方法避免细胞污染。单核细胞通过自动化系统分离后进行细胞保存
(3)自动化方法时间平均需要1小时14分，手工Ficoll方法时间比较长，需要平均3小时15分，自动化解决工业化的主要瓶颈。
(4)单核细胞的保存液配方能解决细胞冻存符合临床用级别。细胞经过冷冻保存后保持活率；
(5)复苏细胞的技术和配方解决单核细胞长期保持后细胞复苏时的伤害。
(6)保存方法(包括25ml冻存袋+18管1ml冻存管)解决目前细胞保存单次使用，达到最小两次复苏使用。
实施例1自动化单核细胞分离与健康人单核细胞保存库的建立
(1)健康人经过一系列的检查包括采血标准检测,肿瘤指标检查，淋巴细胞亚群检测后，确定身体状况正常后进行150ml的血液采集。
(2)按《血液样本交接标准操作程序》与样本运输人员进行。
(3)交接对样本进行表面消毒，放置在安全柜操作台面，准备细胞制备工作。
(4)检查细胞分离套件型号为CS-900.2型，确认产品在有效期内，确认外包装为绿色已灭菌标识。
(5)连接50ml螺口注射器，500ml 0.9％氯化钠注射液袋，从过滤器位置注入淋巴细胞分离液110ml。
(6)将血液样本袋摇晃混匀，用注射器吸取0.5ml样本到无菌EP管，做好信息标记送检，做血细胞分析检测。
(7)抽取70ml样本，加到2个50ml离心管中，35ml/管，3000rpm离心10min，20℃(离心机加速度设置为9，减速度设置为7)，吸取上层血浆，转入2支新的50ml离心管中，17.5ml/管，加入2.5ml DMSO混匀，制备成细胞冻存液，贴好信息标签，封口膜封口，置4℃医用冷藏箱待用。
(8)打开Sepax 2血细胞分离机电源，选择程序：BM applications→Neatcell v312。设置参数：输入血液样本体积120ml；关闭Fixed final volume选项，设置小量最终体积值为12.5ml；清洗2次；较高的回收率。连接分离套件到Sepax 2血细胞分离机上，启动开始程序。
(9)分离完毕，移除耗材，退出程序，关闭Sepax 2血细胞分离机。
(10)准备1个细胞冻存袋和18管冻存管，将剩余细胞样本平均注入冻存袋和18管冻存管
(11)注射器抽取细胞冻存液20ml，分别于4度下均匀缓慢注入冻存袋和18管冻存管，每12分钟加5ml冻存液，完成注入。
(12)冻存袋贴好冻存袋标签，装入外包装袋内进行塑料封口机封口，放入装有冰袋的样本运输箱内，转运到细胞储存库存储，建立健康人单核细胞保存库。
实施例2健康人单核细胞经过冻存后进行复苏培养
1.准备复苏培养液
1.1细胞复苏当天配制复苏培养液，复苏液配方：10％自体血清溶于DMEM中。
1.2预先取出10ml冻存的FBS，待其完全融化，加到200ml离心管中。
1.3向装有10ml FBS的离心管中加入90ml无血清培养液。
1.4用移液管将FBS和无血清培养液完全混匀。
1.5避光置于2-8℃冷藏保存。
2.恒温水浴槽37℃预热。
3.复苏步骤：
3.1将冻存细胞从液氮容器中取出，直接浸入37℃温水中，并不时摇晃使其尽快融化。
3.2从37℃水浴中取出冻存管，酒精擦拭消毒后放入生物安全柜。
3.3打开细胞密封容器，用吸管吸出细胞悬液，加到200ml离心管中，按梯度平衡法通过逐步滴加配制的细胞复苏培养液来稀释冻存保护剂，每步添加复苏液体积后均需摇晃混匀，并且平衡30s，细胞悬液样本体积和复苏培养液体积的比例为1:4。以25ml初始细胞悬液体积为例的梯度平衡法复苏细胞步骤详见下表：
表1：25mL细胞样本所用复苏培养液体积比例
3.4平衡完成后，离心机1400rpm离心10min。
3.5弃去上清液，加入无血清培养液重悬细胞，混匀后取样计数。
3.6调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养。
细胞复苏后，测试细胞的平均回收率、最低细胞回收率、最高细胞回收率、红细胞平均清除率、细胞平均存活率、细菌污染等参数。
将上述方法与传统的手工单核细胞分离方法进行比较，比较结果如下表：
表2自动化数据vs手工Ficoll单核细胞分离比较
从上表中可以看出，采用本申请方法分离细胞，可以在细胞回收率没有明显降低的情况下，显著提升细胞分离操作的时间，且可以得到和手工分离相当的红细胞平均清除率和细胞存活率，而不会引入细菌污染。
实施例3细胞培养
于市售无血清培养基中，加上10％人血白蛋白，以及500000u白介素2，将细胞接种至所述的培养基上进行培养。在0，7，14，21天分别进行取样，并进行细胞计数。
细胞培养增殖倍数结果如下表中所述
细胞的冻存复苏培养增殖情况如图1中所示。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。