一种放射抗拒性肺癌全细胞疫苗及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及肿瘤细胞疫苗，具体地说，涉及一种放射抗拒性肺癌全细胞疫苗及其 制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 肺癌是许多国家常见的恶性肿瘤之一，已经成为人类因肿瘤致死的首位病因，最 新调查显示其已占据中国男性恶性肿瘤发病率及男女恶性肿瘤病死率的首位。常规治疗手 段包括手术、放疗和化疗，目前疗效不理想。这些治疗手段在杀伤或清除肿瘤细胞的同时极 易损伤正常组织，尤其是伤害在机体抗肿瘤防御中占重要地位的免疫系统。患者肿瘤细胞 自身的免疫逃逸和免疫系统的功能障碍促进了肿瘤的发生和发展。因而肿瘤的免疫治疗是 多年来肿瘤治疗研宄领域倍受关注的热点。其中，肿瘤细胞疫苗是研宄较早的一种免疫疗 法，然而在大多数情况下，由于肿瘤细胞的弱免疫原性以及机体对肿瘤的免疫反应是无效 或微弱的，限制了其抗肿瘤的效果。因此，如何提高肿瘤细胞疫苗的抗肿瘤效果是目前抗肿 瘤研宄的方向。
[0003] 中国期刊《广东药学院学报》，2008年02期，刊出的论文"Lewis全细胞肿瘤疫苗 防治C57BL/6小鼠 Lewis肺癌的实验研宄"，探讨了 Lewis全细胞肿瘤疫苗对小鼠 Lewis肺 癌的防治作用。方法：用Lewis全肿瘤疫苗免疫C57小鼠4次，其中首次免疫用含弗氏佐剂 油剂疫苗，第4次免疫的同时在小鼠右腋下接种Lewis肺癌细胞，定期观察小鼠成瘤情况及 小鼠免疫状态变化，用流式细胞术检测疫苗组和对照组小鼠外周血CD4+T细胞、CD8+T细胞 及⑶19+B细胞百分比，以及⑶4/⑶8的变化。结果显示：疫苗组与对照组小鼠成瘤率、成瘤 时间、肿瘤大小差异均无显著性；疫苗组与对照组相比，其外周血⑶4+、⑶8+T淋巴细胞亚 群的百分比差异无显著性，⑶4/⑶8比值的差异也无显著性，疫苗组外周血⑶19+B淋巴细 胞百分比略高于对照组，差异有显著性（P = 0. 014)。结论：用Lewis肿瘤全细胞疫苗不能 提高C57BL/6小鼠的T淋巴细胞免疫功能，可以提高其B淋巴细胞免疫，但不能使小鼠获得 有效的免疫保护。
[0004] 目前尚未见针对肺癌且免疫原性强、抑瘤作用显著、效果持久的全细胞疫苗。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种放射抗拒性肺癌全细胞疫苗及 其制备方法和应用。
[0006] 本发明提供了 一种放射抗拒性肺癌细胞株，所述的放射抗拒性肺癌细胞株的保藏 号为 CCTCC C201537。
[0007] 本发明还提供了所述的放射抗拒性肺癌细胞株的用途，所述的用途选自：
[0008] a)制备肺癌全细胞疫苗；
[0009] b)建立放射抗拒性肺癌动物模型；
[0010] C)研宄肺癌放射抗拒性的机理机制；
[0011] d)筛选对抗放射抗拒性肺癌的药物。
[0012] 本发明还提供了一种放射抗拒性肺癌全细胞疫苗，所述的放射抗拒性肺癌全细胞 疫苗由保藏号为CCTCC C201537的放射抗拒性肺癌细胞株制备得到。
[0013] 作为本发明的一种优选实施方式，所述的放射抗拒性肺癌全细胞疫苗的制备方法 为：收集所述的放射抗拒性肺癌细胞株的培养液，灭活细胞后超声粉碎细胞，充分混匀制得 所述的放射抗拒性肺癌全细胞疫苗。
[0014] 本发明还提供了所述的放射抗拒性肺癌全细胞疫苗在制备预防和/或治疗肺癌 的药物中的应用。
[0015] 本发明还提供了所述的放射抗拒性肺癌全细胞疫苗在制备药物中的用途，所述的 药物的用途选自：
[0016] a)抑制肺癌肿瘤生长；
[0017] b)延长肺癌肿瘤患者的生存时间；
[0018] c)提高肺癌患者的肿瘤免疫功能。
[0019] 本发明还提供了一种预防和/或治疗肺癌的药物，所述的药物由CpG ODN和所述 的放射抗拒性肺癌全细胞疫苗以及药学上可接受的载体组成。
[0020] 作为本发明的一种优选实施方式，所述的CpG ODN是CpG ODN1826。
[0021] 本发明还提供了所述的药物在制备预防和/或治疗肺癌的药物中的应用。
[0022] 本发明还提供了所述的药物的制药用途，所述的制药用途选自：
[0023] a)抑制肺癌肿瘤生长；
[0024] b)延长肺癌肿瘤患者的生存时间；
[0025] c)提高肺癌患者的肿瘤免疫功能。
[0026] 本发明优点在于：
[0027] 1、本发明提供了一种放射抗拒性肺癌细胞株（CCTCC C201537)，其放射抵抗性得 到显著的提高，可用于肺癌耐辐射机理机制研宄、建立耐辐射肿瘤动物模型等。
[0028] 2、本发明利用所述的放射抗拒性肺癌细胞株制备了放射抗拒性肺癌全细胞疫苗， 且证实该疫苗具有显著抑制小鼠肺癌肿瘤生长、促进移植瘤细胞凋亡、降低移植瘤免疫逃 逸TOL-I蛋白表达的作用。显著优于正常的LLC Lewis肺癌细胞株，且发明人在研宄过程 中证实其效果显著优于建立的其他放射抗拒性肺癌细胞株。
[0029] 3、本发明提供了放射抗拒性肺癌细胞株与CpG ODN的组合物，该组合物具备协同 作用，抑瘤作用十分显著，并且部分小鼠肿瘤完全消失，获得持久特异抗肿瘤效果。
[0030] 本发明为肺癌治疗和预防术后转移复发提供了新思路和方法，可采用X线多次照 射制备放射抗拒性肺癌细胞株，制备肺癌全细胞疫苗，再结合CpG ODN从而使小鼠获得主动 特异性抗肿瘤免疫功能。
【附图说明】
[0031] 图I. LLC细胞与R-LLC细胞照射后存活情况。
[0032] 图2.多靶单击模型拟合LLC、R-LLC细胞存活曲线。
[0033] 图3. LLC和R-LLC细胞Survivin蛋白的表达情况。
[0034] 图4. LLC细胞与R-LLC细胞分泌细胞因子水平的比较。
[0035] 图5.各组小鼠肿瘤生长曲线。注：Control (阴性对照组）、CpG (CpG组）、 CpG+LLC (CpG 联合 LLC 瘤苗组）、CpG+R-LLC (CpG 联合 R-LLC 瘤苗组）、LLC (LLC 瘤苗组）、 R-LLC (R-LLC 瘤苗组）。
[0036] 图6.各组小鼠 Kaplan-Meier曲线。
[0037] 图7.各组小鼠移植瘤细胞凋亡病理图（200X)。注：A阴性对照组；B CpG组；C LLC瘤苗组；D R-LLC瘤苗组；E CpG+LLC瘤苗组；F CpG+R-LLC瘤苗组。
[0038] 图8.不同免疫方法小鼠移植瘤凋亡率的比较。
[0039] 图9.不同免疫方法小鼠移植瘤TOL-ImRNA表达水平比较。
[0040] 图10. Western-blotting检测各组小鼠移植瘤PD-Ll蛋白的表达。
[0041] 图11.各组小鼠移植瘤PD-Ll蛋白表达密度值分析。
【具体实施方式】
[0042] 下面结合附图对本发明提供的【具体实施方式】作详细说明。
[0043] 实施例1本发明的放射抗拒性肺癌细胞株的建立
[0044] 1细胞培养与照射方法
[0045] LLC Lewis肺癌细胞株（简称LLC细胞，购于ATCC)用含10%胎牛血清的DMEM培 养液，置于37°C、5% CO2饱和湿度的培养箱内培养，将细胞传代至指数生长期使用。用直线 加速器6MV X线照射，源皮距100cm，表面覆Icm厚组织补偿胶。
[0046] 2放射抗拒性细胞株R-LLC的建立
[0047] 取指数生长期LLC细胞，消化成单细胞悬液接种于25cm2培养瓶中，待细胞生长至 指数生长期后，予照射野7cmX 7cm，6MV X射线，吸收剂量率200cGy/min照射5Gy后继续常 规培养，待细胞达指数生长期末时，消化细胞，将适量细胞接种传代，待细胞再次达到指数 生长期时再照射相同剂量。重复以上过程，总共照射6次，获得放射抗拒性细胞株R-LLC (该 细胞株已于2015年4月22日保藏于中国典型培养物保藏中心（中国武汉大学，430072)， 保藏编号为CCTCC C201537,培养物名称为放射抗拒性Lewis肺癌细胞株R-LLC，下文中简 称R-LLC)，整个照射及培养过程共约4个月。对反复放射线照射得到细胞株R-LLC常规传 代>10代后用于下述实验。
[0048] 3辐射抵抗性的验证
[0049] 3. 1CCK-8 实验
[0050] 在96孔板中配制各100 μ 1的LLC和R-LLC细胞悬液（约5000个细胞左右）。将 培养板在培养箱预培养24h。随后将其分别接受0Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy剂量的照射，24h后 向培养板加入10 μ I CCK-8溶液，将培养板在培养箱内孵育2h。用酶标仪测定细胞悬液在 450nm处的吸光度。
[0051] 3. 2克