Lag-3亲和肽n13、制备方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种LAG-3亲和肽N13、制备方法及其在抗肿瘤方面的应用。
【背景技术】
[0002]现有肿瘤治疗技术中，针对肿瘤的免疫治疗被认为是治愈肿瘤的终极手段。已有研究普遍认为:与传统的治疗方法相比，肿瘤免疫治疗能够激活或者诱导肿瘤患者建立起对肿瘤抗原的特异性免疫应答，清除原发的肿瘤细胞，并且建立免疫记忆，阻止肿瘤的复发和转移。但是由于肿瘤类型的多样性及复杂性，因而肿瘤的免疫治疗既是现有肿瘤研究中的热点，也是研究的难点。
[0003]现有肿瘤免疫治疗中，⑶8+细胞毒T淋巴细胞(CTL)是主要的效应细胞，⑶8+CTL需要通过MHC-1类分子介导的细胞免疫应答过程而被激活。肿瘤抗原等内源性抗原被树突状细胞(DC)等抗原提呈细胞(APC)加工处理后以MHC/表位复合物的形式提呈至APC的表面，该复合物能被T细胞表面的T细胞受体(TCR)识别，从而形成了激活T细胞的第一信号，S卩T细胞对抗原的识别;T细胞活化的第二信号来自协同刺激分子，即APC表达的协同刺激分子与T细胞表面的相应受体或配体相互作用介导的信号。根据产生效应的不同，可将上述共刺激分子分为正性共刺激分子和负性共刺激分子。在负性共刺激分子中，最重要的是CTLA-4、PD-1及LAG-3等分子。
[0004]在肿瘤免疫治疗过程中，肿瘤微环境中负性共刺激分子能引起CTL的功能耗竭和无反应性，而耗竭的CD8+CTL无法发挥细胞毒作用以及正常增值和释放细胞因子，最终引起肿瘤免疫耐受和逃逸。而现有针对肿瘤免疫治疗过程中遇到的最大挑战就是由于肿瘤免疫耐受和逃逸所导致的疗效不佳。因此，探讨通过联合抑制负性共刺激分子所介导的信号通路以打破机体已经建立的肿瘤免疫耐受具有更重要的理论意义和应用价值。
[0005]淋巴细胞活化基因-3(LAG-3，CD223)作为一个重要的负性共刺激分子，是免疫球蛋白超家族成员的一种膜蛋白，在1990年首次发现报道。成熟的LAG-3分子由470个氨基酸构成，主要通过胞外IgV样结构域与主要组织相容性复合体II类分子(MHC-1I)结合。LAG-3通过直接作用于CD8+T细胞而维持自身和肿瘤抗原的免疫耐受性，抗LAG-3单克隆抗体可阻断LAG-3分子的功能，并使肿瘤实质细胞中CD4+T细胞、CD8+T的增殖及功能得以恢复。
[0006]针对LAG-3，已有研究认为，LAG-3及其配体MHC-1I是T细胞活化过程中一对重要的负性共刺激分子，在诱导T细胞无能和免疫耐受维持方面起着非常重要的作用，并介导了肿瘤免疫耐受和逃逸，因而理论而言，如果能够获得LAG-3的亲和物质，避免或者减小LAG-3的负性共刺激作用，对于肿瘤的免疫治疗是有十分重要的意义的。
【发明内容】
[0007]本发明主要目的是提供一种LAG-3亲和肽物质N13，同时提供了该亲和肽的制备方法，将该亲和肽进行相应动物实验后，证明了其可以用于肿瘤的免疫治疗。
[0008]本发明所采取的详细技术方案介绍如下。
[0009]—种LAG-3亲和肽N13，利用噬菌体展示十二肽库液相、固相反向淘选法筛选出来，该亲和肽包括12个氨基酸，分子量为1634.8 Da，其序列如序列表SEQ ID N0.1所示，具体序列为:
Asp-Asp-Phe-Arg-Val-Trp-Trp-Pro-Asn-Phe-Pro-Arg,即DDFRVffffPNFPR0[00?0] 所述LAG-3亲和肽N13，采用Fmoc固相多肽合成法制备而成。
[0011 ]所述LAG-3亲和肽N13作为肿瘤治疗中药物的应用，所述肿瘤具体例如:结肠癌。
[0012]本申请以真核蛋白rhLAG3-Fc为靶分子，以hlgGl-Fc为标签蛋白，通过噬菌体展示肽库高通量技术筛选出了 LAG-3胞外段的亲和肽N13。针对该肽，进一步的体外信号通路阻断试验和小鼠荷瘤试验表明:该肽在肿瘤治疗、延长生物体生存期方面具有较好地应用前景，为生物体肿瘤的免疫治疗提供了新的可能。
【附图说明】
[0013]图1为LAG-3亲和肽N13的ES1-MS质谱分析鉴定结果；
图2为体外信号通路阻断试验的实验结果；
图3为小鼠抑瘤率试验中小鼠体重变化结果；
图4为LAG-3亲和肽N13对荷CT26的BALB/c小鼠移植瘤体积变化的影响结果图；
图5为LAG-3亲和肽N13对荷CT26的BALB/c小鼠生存期的影响结果图。
【具体实施方式】
[0014]下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明。在介绍具体实施例前，对本发明中所涉及部分物料及实验设备情况简要说明如下。
[0015]主要试剂:
IFN-r, PeproTech公司；
Balb/c小鼠，北京维通利华实验动物技术有限公司；
盐酸四环素(Tet)，宝生物工程(大连)有限生物公司；
Protein A/G Mix Magnetic Beads,Milipore 公司；
ER2738菌、Ph.D._12? phage display peptide library kit(即实施例中■菌体展示十二肽库)，NEB公司；
rhLAG-3/Fc蛋白，江苏泰利达生物科技有限公司；
Rink树脂、Fmoc-氨基酸，上海吉尔生化公司；
Ant1-human IgGl-Fc PE、Anti_Human HLA-DR APC，eB1science 公司。
[0016]主要仪器:
低温高速冷冻离心机，Sigma公司；
酶标板，Corning公司；
酶标仪，B1-RAD公司；
多肽合成仪，江苏通州市南兴申海波仪器厂；
冻干机，SYNGENE公司；
FACS Calibur流式细胞仪，K)公司。
[0017]实施例1
本实施例主要简要介绍一下LAG-3亲和肽N13的筛选获得过程。
[0018]本发明中的LAG-3亲和肽N13主要采用液相、固相反向淘选法进行噬菌体展示十二肽库筛选获得，其主要技术流程是:与目标蛋白结合—扩增—与目标蛋白结合—洗脱。在经过3~5轮的筛选后，与靶蛋白LAG-3胞外段有亲和力的噬菌体单克隆逐轮得到富集，回收率大大提高。然后从第三轮、第五轮中挑选蓝斑进行测序，分别共得到多个不同插入十二肽序列，即亲和肽序列，其中N13肽是两种筛选方法所共有的。有关筛选的具体过程介绍如下。
[0019]首先需要介绍的是噬菌体滴度的测定方法，具体步骤为:
(1)于37°C预温LB平板；
(2)用LB培养基对噬菌体样品进行倍比系列稀释，扩增后噬菌体样品稀释范围为:106~109，未扩增的噬菌体样品稀释范围为:101?15;
(3)取20yL活化的ER2738菌液加入离心管，每个噬菌体稀释度一管；
(4)分别在上述离心管内加入50yL不同稀释度的噬菌体，快速震荡混匀，室温孵育2
min；
(5)微波炉融化上层琼脂，待冷却至50°C左右，在每个离心管中加入ImL，快速混匀，倾注于37°C预温的LB平板上；
(6)平板避光冷却，倒置于37°C过夜培养。
[0020]检查平板，计数噬菌斑的平板上蓝色噬菌斑数目，按如下公式计算滴度，
噬菌体滴度(PfuAiL)=(噬菌斑数目X稀释倍数)/10。
[0021]其次，液相反向亲和淘选流程的具体步骤为:
(1)预处理:将ProteinA/G Mix Magnetic Beads悬液混勾后取3yL于I.5mL无菌离心管中，加入ImL TBST洗涤液，弃去液体，重复洗一次；
(2)封闭:加入ImL封闭液，4°C至少封闭20min，期间偶尔上下颠倒混匀；
(3)洗涤:弃去封闭液，用ImLTBST洗涤液洗涤，重复洗I次；
(4)在封闭期间，用TBST缓冲液将真核蛋白rhLGA3-Fc蛋白稀释至终浓度为1nM，取20μL真核rhLGA3_Fc蛋白投入到Protein A/G Mix Magnetic Beads中，室温结合1min;
(5)结合:在ProteinA/G Mix Magnetic Beads与rhLAG3_Fc复合物中快速加入20yL提前用TBST缓冲液稀释至滴度为I X 19 pfu/yL的文库噬菌体，室温孵育结合lOmin，不时上下混匀；
(6)将离心管置于磁架上，弃去上清，用TBST缓冲液洗涤3次；
(7)洗脱与中和:加入20yL洗脱液，室温洗脱3min后，将上清转移至预先已加入60yL中和液的新鲜离心管中，温和的吹打混匀；
此即为与靶蛋白rhLAG3-Fc结合的噬菌体克隆，取其中的1yL测定滴度，根据测定的滴度确定是否需要进行扩增;如果根据滴度计算出，所得到的噬菌体克隆总数不小于2X107，即无需扩增。
[0022](8)重复步骤(I)至(3)，再加入20yL用TBST缓冲液稀释至终浓度为1nM的真核表达蛋白h I gG 1-Fe，室温孵育结合3m i η，期间不时上下颠倒混勾；
(9)结合:在Beads-hlgGl-Fc复合物中快速加入20yL与靶蛋白rhLAG3-Fc结合的噬菌体克隆，室温孵育结合6min; (10)将离心管置于磁架上，把上清转入一新鲜离心管中，得到与标签蛋白hlgGl-Fc不结合，只结合到LAG-3蛋白分子的■菌体克隆；
(11)取出1yL测定其滴度，其余噬菌体克隆进行扩增，纯化得到的次级肽库后测定滴度，并计算其回收率，回收率=[洗脱噬菌体数目/投入噬菌体数目]X 100%;
经过2?3轮的淘选后，即可富集得到含目的多肽的噬菌体。
[0023]噬菌体扩增的具体过程为:
(I)扩增:将ER2738以1:100的比例接种至60 mL的LB液体培养基(含0.l%Tet)，加入待扩增的■菌体(即中和后的洗脱产物)，37°C剧烈振荡培养5?8h;
(2 )沉淀:将上述培养液4°C、12000rpm、离心6 min，取30%的上清于新鲜离心管中，加1/6体积的PEG-8000/NaCl，混匀后4°C沉淀过夜；
(3)重悬:将沉淀过夜的上清4°C、12000rpm、离心6min，弃上清，把沉淀重悬于5 mLTBS 中;
(4)再沉淀:在重悬液中加入1/6体积的PEG-8000/NaCl，冰浴环境下再次沉淀20min；
(5)再重悬:4°C、12000gOrpm、离心2min，弃上清，沉淀重悬于30 yL TBS中；
此即为扩增后的次级肽库，可用作下一轮筛选。
[0024]第三，固相反向亲和淘选流程的具体步骤为:
(1)包被:将50yL、500yg/mL的真核蛋白rhLAG3-Fc包被于96孔板，密闭湿盒4°C孵育过夜；
(2)封闭:弃尽包被液，迅速加满封闭液，4°C孵育Ih;
(3)洗涤:TBST洗涤3次；